新癌基因fascin在食管癌細(xì)胞中過表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、人類的fascin基因，亦即fascin-1，定位于7p22，編碼一種55kD的球形蛋白，結(jié)合捆綁細(xì)胞微絲F-Actin，主要在細(xì)胞的分裂增殖、變形與移動(dòng)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮功能。
　　 本課題組以往曾率先研究發(fā)現(xiàn)，fascin 是一個(gè)重要的新的癌基因，在食管癌的發(fā)生發(fā)展中顯著異常過表達(dá)，在癌細(xì)胞的增殖與侵襲中發(fā)揮功能，與患者的不良預(yù)后相關(guān)，但過表達(dá)調(diào)控機(jī)制不明。
　　 本論文前期，我們曾研究確定，在食管癌細(xì)胞中，5 ′端

2、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的?74~?41 是fascin基因的核心啟動(dòng)子區(qū)段。在此基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步研究確定fascin基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活元件，在本論文中，首先，通過綜合運(yùn)用生物信息學(xué)分析、定點(diǎn)突變、雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測、電泳遷移率變動(dòng)分析（EMSA ）和super-EMSA 等實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，進(jìn)一步把fascin基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活元件所在位點(diǎn)，縮窄到?70~?60 這一更短區(qū)段，重組表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子Sp1 能夠與之結(jié)合，而食管癌細(xì)胞的核蛋白提取物

3、中也確實(shí)檢測到了Sp1 蛋白的表達(dá)。
　　 其次，通過聯(lián)合應(yīng)用基因過表達(dá)、RNA 干擾、定量RT-PCR、western blot和報(bào)告基因活性檢測等實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，從正反兩個(gè)方面研究證明，轉(zhuǎn)錄因子Sp1 不僅能夠結(jié)合fascin基因的?70~?60 區(qū)段序列，而且還能夠激活fascin基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯。
　　 再次，為了鑒定出食管癌細(xì)胞中，磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子Sp1的上游激酶，針對不同細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在本論

4、文中，分別用8種特異性激酶抑制劑處理食管癌細(xì)胞，然后檢測fascin基因的表達(dá)變化或報(bào)告基因的活性改變。結(jié)果顯示，在食管癌細(xì)胞中，只有MEK1/2的特異性抑制劑，不但能夠使下游激酶ERK1/2和轉(zhuǎn)錄因子Sp1的磷酸化程度明顯降低，而且還能夠明顯抑制fascin基因mRNA與蛋白的表達(dá)，或報(bào)告基因的活性。而與此同時(shí)，當(dāng)應(yīng)用RNAi 使ERK1/2的表達(dá)下調(diào)時(shí)，也同樣可導(dǎo)致fascin基因的表達(dá)顯著降低。這些結(jié)果一致表明，食管癌細(xì)胞中，ER

5、K1/2 是直接磷酸化轉(zhuǎn)錄因子Sp1，激活fascin基因轉(zhuǎn)錄的上游激酶。
　　 最后，為了鑒定出激活食管癌細(xì)胞MEK1/2 →ERK1/2 →Sp1 →fascin 這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的細(xì)胞外活性分子，在本論文中，又分別研究了表皮生長因子EGF和轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1 對上述細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。結(jié)果顯示，隨著EGF(50 ng/ml)刺激時(shí)間的延長，從5 min 到 24 h，食管癌細(xì)胞fascin基因的mRNA和蛋白表達(dá)

6、水平逐漸升高；與此不同，TGF-β1（10 ng/ml)的刺激，對食管癌細(xì)胞fascin基因的表達(dá)未見明顯影響。而進(jìn)一步的報(bào)告基因、EMSA、western blot 及免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著EGF 刺激，Sp1與?70~?60 核心元件的結(jié)合明顯增加，fascin基因啟動(dòng)子的活性明顯增強(qiáng)，同時(shí)磷酸化的ERK1/2和Sp1 也相應(yīng)明顯增多；而如果預(yù)先用MEK1/2 特異性抑制劑處理，阻斷MEK1/2 →ERK1/2 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

7、通路，然后再進(jìn)行EGF 刺激，則EGF 誘導(dǎo)fascin基因表達(dá)的上述效果隨之消失。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同說明，EGF 是食管癌細(xì)胞中促進(jìn)fascin基因過表達(dá)的重要細(xì)胞外活性分子，并且主要是通過激活MEK1/2 →ERK1/2 →Sp1 這一細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路得以實(shí)現(xiàn)的。
　　 總結(jié)以上諸實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，本論文深入研究揭示食管癌細(xì)胞中fascin基因的過表達(dá)調(diào)控機(jī)制，主要結(jié)論包括：1 ）fascin基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活元件位于其5 ′端轉(zhuǎn)

8、錄調(diào)控區(qū)?70~?60區(qū)段；2 ）fascin基因的轉(zhuǎn)錄激活因子是磷酸化的Sp1 ；3 ）食管癌細(xì)胞中，fascin基因的過表達(dá)主要由MEK1/2 →ERK1/2 →Sp1 等細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)；4 ）EGF 是激活食管癌細(xì)胞，使fascin基因過表達(dá)的細(xì)胞外活性分子。這不但有助于全面揭示癌基因fascin 在食管癌細(xì)胞中的過表達(dá)調(diào)控機(jī)制，而且還十分有助于針對fascin 及其相關(guān)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尋找干預(yù)食管癌發(fā)生發(fā)展的方法提供理論指