電場(chǎng)刺激下皮層神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)dcc分子基因表達(dá)的研究

1、<p>　　單位代碼 10006 </p><p>　　學(xué) 號(hào) 10101008 </p><p>　　分類(lèi)號(hào) </p><p>　　密 級(jí) 秘 密 </p><p><b>　　畢業(yè)設(shè)計(jì)(論文)</b><

2、;/p><p>　　電場(chǎng)刺激下皮層神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)DCC分子基因表達(dá)的研究</p><p><b>　　2014年5月</b></p><p><b>　　北京航空航天大學(xué)</b></p><p>　　本科生畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）任務(wù)書(shū)</p><p>　　Ⅰ、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）題目：<

3、/p><p>　　電場(chǎng)刺激下皮層神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)DCC分子基因表達(dá)的研究 </p><p>　　Ⅱ、畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）使用的原始資料（數(shù)據(jù)）及設(shè)計(jì)技術(shù)要求：</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)研究在文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)導(dǎo)向生長(zhǎng)分子Netrin-1能夠有效

4、地與其受體DCC結(jié)合，以促進(jìn)神經(jīng)突起的導(dǎo)向延伸。但是，外加電場(chǎng)對(duì)神經(jīng)導(dǎo)向生長(zhǎng)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬采用不同條件的電場(chǎng)刺激，檢測(cè)原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元內(nèi)受體DCC的表達(dá)，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)電刺激后神經(jīng)突起的延伸生長(zhǎng)情況，RT-PCR對(duì)DCC基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)計(jì)技術(shù)要求包括大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)、細(xì)胞電場(chǎng)加載實(shí)驗(yàn)、免疫熒光檢測(cè)、RT-PCR技術(shù)。

5、 </p><p>　?、蟆厴I(yè)設(shè)計(jì)（論文）工作內(nèi)容：</p><p>　　工作內(nèi)容主要包括三個(gè)方面：1、大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)：采用原代培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)出生當(dāng)天的新生SD大鼠乳鼠進(jìn)行大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定。2、電場(chǎng)加載實(shí)驗(yàn)：采用電場(chǎng)刺激儀，利用鉑電極對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行電刺激，分別檢測(cè)0mv, 50mv，100mv作用2h、4

6、h后，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。刺激后的細(xì)胞，進(jìn)行多聚甲醛固定后，采用免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)β-tublin III，觀察神經(jīng)突起的延伸變化。3、RT-PCR檢測(cè)DCC分子：對(duì)刺激后的細(xì)胞進(jìn)行Trizol裂解后再RNA提取，對(duì)DCC分子基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)其基因表達(dá)水平。 </p><p><

7、;b>　?、?、主要參考資料：</b></p><p>　　1、Rajasekharan S, Baker KA, Horn KE, Jarjour AA, Antel JP, Kennedy TE: Netrin 1 and Dcc regulate oligodendrocyte process branching and membrane extension via Fyn and RhoA

8、. Development 2009, 136(3):415-426. </p><p>　　2、Kim, T. H., Lee, H. K., Seo, I. A., Bae, H. R., Suh, D. J., Wu, J., Rao, Y., Hwan

9、g, K. G. and Park, H. T. (2005) Netrin induces down-regulation of its receptor, Deleted in Colorectal Cancer, through the ubiquitin-proteasome pathway in the embryonic cortical neuron. J Neurochem, 95, 1-8.

10、 </p><p>　　3、Li, X., Gao, X., Liu, G., Xiong, W., Wu, J. and Rao, Y. (2008)

11、Netrin signal transduction and the guanine nucleotide exchange factor DOCK180 in attractive signaling. Nat Neurosci, 11, 28-35. </p><p&

12、gt;　　4、Norman, L. L., Stroka, K. and Aranda-Espinoza, H. (2009) Guiding axons in the central nervous system: a tissue engineering approach. Tissue Eng Part B Rev, 15, 291-305.

13、 </p><p>　　5、Smith, D. H. (2009) Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol, 89, 231-239. </p><p>　　6、Rajasekharan S,

14、 Bin JM, Antel JP, Kennedy TE: A central role for RhoA during oligodendroglial maturation in the switch from netrin-1-mediated chemorepulsion to process elaboration. J Neurochem 2010, 113(6):1589-1597. </p><

15、p>　　7、Abigail N Koppes, Angela M Seggio and Deanna M Thompson. Neurite outgrowth is significantly increased by the simultaneous presentation of Schwann cells and moderate exogenous electric fields.2011, J. Neural Eng.

16、 8, 046023 (13pp).</p><p>　　生物與醫(yī)學(xué)工程 學(xué)院（系） 生物工程 專(zhuān)業(yè)類(lèi) 101011 班</p><p>　　學(xué)生 陽(yáng)雨辰 </p><p>　　畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）時(shí)間： 2014 年 3 月 7 日至 2014 年 6月10日</p><p>　　答辯時(shí)間： 年 月

17、 日</p><p>　　成 績(jī)： </p><p>　　指導(dǎo)教師： </p><p>　　兼職教師或答疑教師（并指出所負(fù)責(zé)部分）：</p><p>　　系（教研室） 主任（簽字）： </p><p>　　注：任務(wù)書(shū)應(yīng)

18、該附在已完成的畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的首頁(yè)。</p><p><b>　　本人聲明</b></p><p>　　我聲明，本論文及其研究工作是由本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立完成的，在完成論文時(shí)所利用的一切資料均已在參考文獻(xiàn)中列出。</p><p><b>　　作者：陽(yáng)雨辰</b></p><p><b>

19、　　簽字：</b></p><p>　　時(shí)間：2014年 5 月</p><p>　　電場(chǎng)刺激下皮層神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)DCC分子基因表達(dá)的研究</p><p>　　學(xué) 生：陽(yáng)雨辰</p><p><b>　　指導(dǎo)老師：劉美麗</b></p><p><b>　　摘要</b

20、></p><p>　　目的 根據(jù)建立的新生SD大鼠皮層神經(jīng)元原代體外培養(yǎng)的方法培養(yǎng)皮層神經(jīng)元，并對(duì)培養(yǎng)成熟的神經(jīng)元做免疫熒光染色，以鑒定所培養(yǎng)的神經(jīng)元。對(duì)所培養(yǎng)的神經(jīng)元在不同電壓下加載不同時(shí)間，明確不同條件電場(chǎng)刺激下神經(jīng)導(dǎo)向分子受體DCC分子的基因表達(dá)水平。為研究電場(chǎng)與神經(jīng)導(dǎo)向生長(zhǎng)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法 對(duì)體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元在電壓為50mV、100mV條件下分別加載2h和4h，并對(duì)電場(chǎng)加載的神經(jīng)元進(jìn)

21、行Tubulin-Ⅲ免疫熒光染色觀察神經(jīng)元在不同電場(chǎng)條件下的形態(tài)變化以及軸突長(zhǎng)度的變化；以及通過(guò)RT-PCR以及Realtime PCR獲取DCC分子的基因表達(dá)情況，確定DCC分子基因表達(dá)的最佳條件，為后續(xù)神經(jīng)導(dǎo)向生長(zhǎng)機(jī)制提供依據(jù)。結(jié)果 原代皮層神經(jīng)元在體外培養(yǎng)情況下，7天可達(dá)最好細(xì)胞狀態(tài)。電場(chǎng)刺激下神經(jīng)元的軸突長(zhǎng)度都有顯著性地增加，DCC分子在電壓為50mV條件下加載4h基因表達(dá)顯著增加。結(jié)論 成功體外培養(yǎng)原代皮層神經(jīng)元，初步確定了D

22、CC分子基因表達(dá)最佳的電場(chǎng)刺激條件，具有一定實(shí)際意義和應(yīng)用價(jià)值。</p><p>　　關(guān)鍵詞：神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)、電場(chǎng)加載、免疫熒光染色、DCC受體、RT-PCR</p><p>　　DCC Gene Expression in Cortical Neuron in the condition of Electrical Stimulation</p><p>　　

23、Author: YANG Yu-chen</p><p>　　Tutor: LIU Mei-li</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　Objective: Electrical stimulation can promote axonal outgrowth, but its mechanism is no

24、t clear yet. In this study, the axonal guidance growth cues Netrin-1 receptor DCC (Deleted in Colorectal Cancer) was investigated by RT-PCR assay after electrical stimulation. Methods: rat cortical neurons were primary c

25、ultured here, then cortical neurons were identified by IF (immuno-fluorescence) assay with mouse anti-β Tubulin-Ⅲ antibody. Primary cultured cortical neurons were subjected to electrical stimul</p><p>　　Key

26、words: Primary Cultured cortical neuron, Electrical stimulation, IF, DCC, RT-PCR</p><p><b>　　目錄</b></p><p><b>　　1緒論1</b></p><p><b>　　1.1 概述1</b&g

27、t;</p><p>　　1.1.1 神經(jīng)系統(tǒng)的功能與組成1</p><p>　　1.1.2 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)1</p><p>　　1.1.3 神經(jīng)細(xì)胞鑒定的主要方法2</p><p>　　1.2 課題背景3</p><p>　　1.2.1 神經(jīng)損傷及修復(fù)3</p><p>　　1.2.

28、2 神經(jīng)導(dǎo)向生長(zhǎng)5</p><p>　　1.3 研究目的8</p><p>　　1.4 論文構(gòu)成及研究?jī)?nèi)容8</p><p>　　2實(shí)驗(yàn)材料和方法10</p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備10</p><p>　　2.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品10</p><p>　　2.1.2 實(shí)驗(yàn)

29、器材10</p><p>　　2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物10</p><p>　　2.2 大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)10</p><p>　　2.2.1 手術(shù)器械的高壓消毒10</p><p>　　2.2.2 DMEM高糖培養(yǎng)基過(guò)濾滅菌11</p><p>　　2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)流程11</p>&

30、lt;p>　　2.3 電場(chǎng)加載實(shí)驗(yàn)12</p><p>　　2.4 免疫熒光染色12</p><p>　　2.4.1 準(zhǔn)備細(xì)胞12</p><p>　　2.4.2 染色流程12</p><p>　　2.5 FDA（Fluorescein diacetate 乙酰熒光素）染色13</p><p>　　2.

31、5.1 配制染色所需的試劑13</p><p>　　2.5.2 染色步驟13</p><p>　　2.6 RT-PCR檢測(cè)DCC分子14</p><p>　　2.6.1 總RNA的提取14</p><p>　　2.6.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA15</p><p>　　2.6.3 PCR反應(yīng)16</p&g

32、t;<p>　　2.6.4 DNA電泳檢測(cè)16</p><p>　　2.7 Realtime PCR檢測(cè)DCC分子基因表達(dá)17</p><p>　　3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論18</p><p>　　3.1 神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)18</p><p>　　3.1.1 培養(yǎng)初期神經(jīng)細(xì)胞18</p><p>　　

33、3.1.2 培養(yǎng)中期神經(jīng)細(xì)胞18</p><p>　　3.1.3 培養(yǎng)后期神經(jīng)細(xì)胞19</p><p>　　3.2 神經(jīng)元染色結(jié)果19</p><p>　　3.2.1 Tubulin-Ⅲ免疫熒光染色20</p><p>　　3.2.2 DAPI核染以及疊加結(jié)果22</p><p>　　3.2.3 FDA染色結(jié)

34、果24</p><p>　　3.2.4 不同電刺激電壓及刺激時(shí)間條件下神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度變化24</p><p>　　3.3 RT-PCR檢測(cè)DCC分子基因表達(dá)25</p><p>　　3.3.1 所有實(shí)驗(yàn)組RT-PCR結(jié)果25</p><p>　　3.3.2 RT-PCR灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果25</p><p>　　

35、3.4 Real time PCR檢測(cè)DCC分子基因表達(dá)結(jié)果28</p><p>　　4結(jié)論與展望29</p><p><b>　　致謝31</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)32</b></p><p><b>　　緒論</b></p>&l

36、t;p><b>　　概述</b></p><p>　　神經(jīng)系統(tǒng)的功能與組成</p><p>　　神經(jīng)系統(tǒng)(nervous system)在機(jī)體內(nèi)起主導(dǎo)作用。人體是一個(gè)復(fù)雜的機(jī)體，各器官、系統(tǒng)的功能不是孤立的，它們之間互相聯(lián)系、互相制約；同時(shí)，人是生活在一個(gè)環(huán)境多變的條件中，環(huán)境的變化隨時(shí)影響著體內(nèi)的各種功能。這就需要對(duì)體內(nèi)各種功能的實(shí)現(xiàn)進(jìn)行有效的調(diào)節(jié)，使機(jī)體適應(yīng)

37、內(nèi)外環(huán)境的變化，神經(jīng)系統(tǒng)就能實(shí)現(xiàn)這一調(diào)節(jié)功能。機(jī)體內(nèi)部和外部環(huán)境的各種信息（尤其是電場(chǎng)的刺激），由感受器接受后，通過(guò)周?chē)窠?jīng)中樞和各級(jí)中樞進(jìn)行整合，以維持機(jī)體與內(nèi)部和外部環(huán)境的相對(duì)平衡。神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞包括神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及神經(jīng)突觸。</p><p>　　（1）神經(jīng)元 神經(jīng)元(neuron)是一種高度特化的細(xì)胞，它能感受刺激并且傳導(dǎo)興奮。神經(jīng)元由胞體和突觸這兩個(gè)部分構(gòu)成。神經(jīng)元突觸根據(jù)形狀和機(jī)能可以分為

38、樹(shù)突(dendrite)和軸突(axon)。樹(shù)突較短但分支較多，并且各類(lèi)神經(jīng)元樹(shù)突的數(shù)目不等，形態(tài)也各不相同。每個(gè)神經(jīng)元只發(fā)出一條軸突而軸突的長(zhǎng)短是不一樣的，神經(jīng)元發(fā)生的電信號(hào)則沿軸突傳出。 根據(jù)突起的數(shù)目，可將神經(jīng)元從形態(tài)上分為假單極神經(jīng)元、雙極神經(jīng)元和多極神經(jīng)元[2]三大類(lèi)[1] 。 （2）神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(neuroglia)的數(shù)目是神經(jīng)元10~50倍[3] ，膠質(zhì)細(xì)胞的突起沒(méi)有樹(shù)突和軸突的分別，胞體比較小，胞

39、漿中沒(méi)有神經(jīng)原纖維和尼氏體而且它也不具有傳導(dǎo)神經(jīng)沖動(dòng)的功能。神經(jīng)膠質(zhì)對(duì)神經(jīng)元胞體起著營(yíng)養(yǎng)保護(hù)和支持絕緣的作用，并且參與血腦屏障的構(gòu)成[2] 。 （3）神經(jīng)突觸 突觸就是神經(jīng)元之間互相接觸的方式，因?yàn)樯窠?jīng)元間不是細(xì)胞質(zhì)的互相溝通。突觸通常是一個(gè)神經(jīng)元的軸突與另一個(gè)神經(jīng)元的樹(shù)突借其發(fā)生聯(lián)系，神經(jīng)的電信號(hào)是由一個(gè)神經(jīng)元通過(guò)突觸傳遞到另一個(gè)神經(jīng)元的。</p><p>　　神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)主要材料</p>

40、;<p>　　神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)被認(rèn)為比那些在體外多次傳代的神經(jīng)細(xì)胞株更能代表體內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞的正常發(fā)育狀態(tài)[13] 。國(guó)內(nèi)從60 年代開(kāi)始已有人[14,15] 培養(yǎng)腦神經(jīng)細(xì)胞。</p><p>　　而由于神經(jīng)細(xì)胞是一種高度分化的細(xì)胞，在動(dòng)物出生后很少分裂；而且神經(jīng)元分化程度高，神經(jīng)突起發(fā)育成熟，從成熟神經(jīng)組織分離神經(jīng)元，會(huì)使神經(jīng)元受到更大的普遍損傷，因此對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行分離培養(yǎng)的要求較為特殊，難度也較大

41、。傳統(tǒng)的神經(jīng)元原代培養(yǎng)使用的實(shí)驗(yàn)材料均為胎鼠[16-18] ，用新生鼠的較少[19] 。</p><p>　　這是由于鼠類(lèi)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在出生時(shí)都沒(méi)有分化成熟，這種細(xì)胞具有比較強(qiáng)的適應(yīng)環(huán)境的能力，更易成活。臨產(chǎn)(21d) 的胚胎和新生動(dòng)物[20]是最好的腦細(xì)胞培養(yǎng)物的選擇。新生鼠和胚胎鼠是不同的，它的神經(jīng)元的分化程度更高一些，神經(jīng)突起發(fā)育更加成熟，神經(jīng)元和神經(jīng)元之間以及神經(jīng)元和纖維組織之間的連接都要更加緊

42、密，在實(shí)驗(yàn)操作的消化過(guò)程中更容易造成損傷[21] ，由于取材于新生鼠的腦組織的神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng)的成功率比較低，目前國(guó)內(nèi)外傳統(tǒng)的神經(jīng)元原代培養(yǎng)所使用的實(shí)驗(yàn)材料都是胚胎鼠，使用較少的新生鼠。然而，用胚胎鼠做實(shí)驗(yàn)材料的缺點(diǎn)不僅在于耗資大，還在于孕鼠的孕期比較難以控制，因此近年來(lái)多用新生鼠代替胎鼠進(jìn)行神經(jīng)元原代培養(yǎng)。</p><p>　　神經(jīng)細(xì)胞鑒定的主要方法</p><p>　?。?）免疫細(xì)胞

43、化學(xué)技術(shù)</p><p>　　在體外培養(yǎng)環(huán)境下，神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)變化極大。目前通常采用的神經(jīng)元鑒定方法為免疫染色方法。</p><p>　　免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是利用特異性抗體顯示組織或細(xì)胞化學(xué)成分（抗原）的技術(shù)。其優(yōu)點(diǎn)在于能夠?qū)?xì)胞的某種或者某些化學(xué)成分進(jìn)行特異性的顯示。免疫細(xì)胞化學(xué)方法包括固定，制片和反應(yīng)三個(gè)基本步驟[22] 。</p><p>　　免疫酶組織化學(xué)采用

44、酶標(biāo)記的抗體直接或者通過(guò)特異性抗體間接地與組織中的抗原結(jié)合，然后用酶的特異性底物以及顯色系統(tǒng)來(lái)顯示抗原存在的部位。最常用來(lái)標(biāo)記抗體的酶有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）。HRP的底物及顯色系統(tǒng)通常用過(guò)氧化氫-二氨基苯胺，而AP的底物及顯色系統(tǒng)一般用磷酸萘酯-偶氮染料。該方法的突出優(yōu)點(diǎn)是能夠較好地顯示細(xì)胞輪廓，特別是經(jīng)過(guò)適當(dāng)稱染之后，陽(yáng)性信號(hào)定位更明確[23] 。免疫酶組織化學(xué)染色標(biāo)本經(jīng)過(guò)封固后可以較長(zhǎng)時(shí)間保存，便于進(jìn)行回顧性

45、研究。該方法的主要缺點(diǎn)是反應(yīng)步驟相對(duì)繁雜，因涉及酶促反應(yīng)，反應(yīng)條件相對(duì)苛刻，對(duì)顯色控制的技術(shù)要求較高。</p><p>　　免疫熒光組織化學(xué)采用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來(lái)顯示抗原存在部位。最常用來(lái)標(biāo)記抗體的熒光物質(zhì)有異硫氰酸熒光素（FITC），四甲基異硫氰酸羅達(dá)明（TRITC），德克薩斯紅(TR)[24] 。免疫熒光組織化學(xué)反應(yīng)后，以一定波長(zhǎng)的光進(jìn)行激發(fā)，抗原存在部分發(fā)出特定波長(zhǎng)的熒光，利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察和攝影。其有

46、點(diǎn)是比較簡(jiǎn)便和快捷，而主要缺點(diǎn)是熒光容易淬滅，需及時(shí)進(jìn)行觀察和攝影，染色標(biāo)本不能長(zhǎng)時(shí)間保存。</p><p>　　常用的神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志性物質(zhì)列舉如下：</p><p>　　NSE，神經(jīng)元型烯醇化酶。</p><p>　　Tubulin，微管蛋白。</p><p>　　MAP2(Microtubule-associated Protein 2)，

47、微管相關(guān)蛋白2。</p><p>　　膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白。</p><p>　　NF即神經(jīng)中絲，是神經(jīng)元特異的標(biāo)志物，主要分布在胞漿，尤以突起的起始部為多。</p><p>　　nestin（巢蛋白）：神經(jīng)巢蛋白，是最大的中間絲蛋白，分子量為210-240KDa，nestin劃分為Ⅵ類(lèi)中間絲，是神經(jīng)干細(xì)胞的一種特異性標(biāo)志物，在

48、胚胎時(shí)期的神經(jīng)干細(xì)胞和未成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，出生后在成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞中消失，但在活動(dòng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)重新出現(xiàn)。成熟的CNS中不表達(dá)nestin。</p><p>　?。?）DAPI染核技術(shù)</p><p>　　DAPI染色原理：DAPI（4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚）與DNA雙螺旋的凹槽部分可以發(fā)生相互作用，從而與DNA的雙鏈緊密結(jié)合。且結(jié)合后可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光[

49、25]。用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察時(shí)，DAPI染液是用紫外光波長(zhǎng)的光進(jìn)行激發(fā)。當(dāng)DAPI和雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，吸收波長(zhǎng)的最高峰在358 nm處，發(fā)射波長(zhǎng)的最高峰在461 nm處，而它光的波長(zhǎng)范圍是包括從藍(lán)色到青綠色這一大段。DAPI不僅可以喝雙鏈DNA結(jié)合，它也可以和RNA結(jié)合，但它與RNA結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度沒(méi)有它與DNA結(jié)合時(shí)的強(qiáng)度高，它的光波長(zhǎng)范圍約在400 nm附近，呈現(xiàn)的是藍(lán)色[26] 。</p><p>&l

50、t;b>　　課題背景</b></p><p><b>　　神經(jīng)損傷及修復(fù)</b></p><p><b>　　1、概述</b></p><p>　　神經(jīng)系統(tǒng)在機(jī)體的正常生命活動(dòng)中扮演了重要角色。機(jī)體內(nèi)各器官組織間的協(xié)調(diào)以及機(jī)體對(duì)外界環(huán)境的變化作出反應(yīng)都需要神經(jīng)系統(tǒng)的參與。神經(jīng)系統(tǒng)損傷可能會(huì)造成感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)功

51、能的喪失甚至意識(shí)和行為的改變，這可能會(huì)對(duì)傷員的生活自理能力造成影響也會(huì)對(duì)傷員家庭以及社會(huì)帶來(lái)比較大的負(fù)擔(dān)[27]，所以神經(jīng)損傷的修復(fù)就更加重要了。神經(jīng)損傷不僅傷害性大，它在各種自然災(zāi)害以及意外事故中也非常常見(jiàn)。在細(xì)胞層面，神經(jīng)損傷主要表現(xiàn)為神經(jīng)元的喪失或神經(jīng)纖維受損[27]；在組織器官層面，神經(jīng)損傷可以表現(xiàn)為骨骼肌功能喪失甚至萎縮[28]以及部分器官無(wú)法對(duì)神經(jīng)調(diào)控進(jìn)行反應(yīng)繼而喪失功能，進(jìn)而造成人體生理調(diào)控紊亂而帶來(lái)嚴(yán)重后果。</p

52、><p>　　神經(jīng)損傷的修復(fù)在微觀層面需要神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)纖維的再生，以及新生的神經(jīng)細(xì)胞向損傷部位的遷移[27]，并且受損處的神經(jīng)細(xì)胞需要與適當(dāng)?shù)陌袠?biāo)建立突觸聯(lián)系，以此恢復(fù)其功能。但是這個(gè)過(guò)程卻會(huì)因?yàn)樗枇字囊种谱饔?、神?jīng)元細(xì)胞死亡以及損傷處缺少合適的基質(zhì)而變得困難[28-31]。同時(shí)，神經(jīng)修復(fù)也會(huì)受到環(huán)境因素的影響，如：神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的參與、損傷處表面形貌以及外部的生物物理環(huán)境因素等[33]。于是我們需要

53、尋找能有效促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)的辦法。</p><p><b>　　2、主要方法</b></p><p>　　神經(jīng)損傷修復(fù)對(duì)神經(jīng)損傷病人生活自理、減輕疾病痛苦以及恢復(fù)正常生理功能都是非常重要的。傳統(tǒng)的神經(jīng)損傷修復(fù)可以歸納為兩個(gè)主要的方式：一種是直接修復(fù)受損處，以自體修復(fù)或者移植的方式實(shí)現(xiàn)損傷的愈合。這種方式在臨床多采用外科損傷修復(fù)技術(shù)，包括神經(jīng)斷端縫合修復(fù)和軸索修復(fù)。神經(jīng)

54、斷端縫合修復(fù)即采用外科縫合的方法把斷裂的神經(jīng)重新縫合在一起，其中無(wú)縫縫合技術(shù)受到越來(lái)越多的重視，因?yàn)樗梢杂行p少瘢痕的出現(xiàn)[27]。除外科損傷修復(fù)以外，神經(jīng)的自體移植以及神經(jīng)組織工程也為神經(jīng)損傷修復(fù)帶來(lái)了新的力量；另一種是間接修復(fù)損傷，以減緩對(duì)神經(jīng)再生抑制的方法實(shí)現(xiàn)損傷處細(xì)胞的再生以實(shí)現(xiàn)損傷修復(fù)。這種方式主要表現(xiàn)為通過(guò)基因工程的方法向細(xì)胞中導(dǎo)入促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的細(xì)胞因子[34]或是導(dǎo)入阻抑nogo蛋白的基因[35]，以此促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)

55、。</p><p>　　干細(xì)胞為神經(jīng)損傷修復(fù)注入了新鮮的血液。神經(jīng)干細(xì)胞已經(jīng)在臨床應(yīng)用，并且取得了一定的療效。但是它仍有很多缺陷，如：干細(xì)胞來(lái)源有限，無(wú)法大量應(yīng)用于臨床治療；干細(xì)胞在局部的存活率較低，應(yīng)用的有效性不夠；臨床上對(duì)干細(xì)胞在損傷處發(fā)揮的作用檢測(cè)機(jī)制不完善，無(wú)法判斷干細(xì)胞是否發(fā)揮了神經(jīng)元的作用等[27]。</p><p>　　電場(chǎng)對(duì)神經(jīng)的影響已經(jīng)有了大量的闡述。早在1982年，Ba

56、ker等[36]在傷口修復(fù)以及神經(jīng)發(fā)育的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞及其支持細(xì)胞如施旺氏細(xì)胞都存在于穩(wěn)定的電場(chǎng)梯度中，而該電場(chǎng)強(qiáng)度就在40-140mV/mm的范圍內(nèi)。而神經(jīng)元在體外電場(chǎng)環(huán)境中會(huì)表現(xiàn)出不一樣的特征：陰極趨向性[37]、陽(yáng)極趨向性[38]、神經(jīng)軸分支增加[39]、神經(jīng)發(fā)生增加[40]或者沒(méi)有反應(yīng)[41]。由此，電場(chǎng)對(duì)神經(jīng)損傷修復(fù)也有了大量的研究。臨床上，電刺激對(duì)周?chē)窠?jīng)的功能康復(fù)有比較好的效果。不同頻率的電刺激對(duì)周?chē)窠?jīng)的作用也是

57、不一樣的，低頻可誘導(dǎo)施旺氏細(xì)胞增殖以及髓鞘的修復(fù)[42]；中頻可提高疼痛閾值，減輕疼痛感；高頻可改善損傷區(qū)的血液循環(huán)以促進(jìn)修復(fù)[43]。另外，對(duì)脊髓損傷動(dòng)物模型施加外加直流電場(chǎng)（200mV/mm）發(fā)現(xiàn)，脊髓血流量、誘發(fā)電位以及脊髓的功能都有了較大的改善[44]。電場(chǎng)對(duì)神經(jīng)元的遷移也有很重要的作用。Yao等[45]研究發(fā)現(xiàn)大鼠海馬體細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器會(huì)在電場(chǎng)作用下發(fā)生不對(duì)稱分布，從而導(dǎo)致細(xì)胞的不對(duì)稱分布。Jaffe和Poo[46]發(fā)現(xiàn)雞背側(cè)神

58、經(jīng)節(jié)外植體在穩(wěn)定的dc電場(chǎng)中會(huì)表現(xiàn)出電場(chǎng)不同極性的遷移。但是電場(chǎng)</p><p><b>　　神經(jīng)導(dǎo)向生長(zhǎng)</b></p><p><b>　　1、概述</b></p><p>　　大腦內(nèi)的信息傳遞過(guò)程從很大程度上是由內(nèi)部神經(jīng)連接網(wǎng)絡(luò)決定的。中央神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中神經(jīng)元的連接程度是十分驚人的。成人腦中每1012個(gè)神經(jīng)元平

59、均與1000個(gè)靶細(xì)胞相連，因此形成了一個(gè)特定的回路，這個(gè)回路模式是否正確對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能是否正確非常重要。</p><p>　　在神經(jīng)系統(tǒng)整體形態(tài)形成的過(guò)程中，神經(jīng)元在特定的區(qū)域產(chǎn)生，然后通過(guò)特定的途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)移，直到到達(dá)其目的地。每一個(gè)神經(jīng)元形成一組表現(xiàn)其表現(xiàn)型的樹(shù)突以及延伸以形成特定途徑到達(dá)其突觸靶標(biāo)的神經(jīng)軸[48]。這個(gè)過(guò)程即為神經(jīng)軸的導(dǎo)向生長(zhǎng)。</p><p>　　神經(jīng)軸的導(dǎo)向生長(zhǎng)需要

60、其與基質(zhì)的粘附作用以及引導(dǎo)信號(hào)提供的方向相關(guān)的信息。粘附受體將胞外基質(zhì)的信號(hào)傳導(dǎo)給細(xì)胞骨架，因此給生長(zhǎng)椎的移動(dòng)提供了必須的牽引力，同時(shí)引導(dǎo)信號(hào)在與粘附受體吸引和排斥的過(guò)程中為其提供了方向的信息[49-52]。然而，因?yàn)檎掣椒肿右部梢蕴峁┓较蛐畔⑿薷囊龑?dǎo)信號(hào)提供的信息，所以吸引和排斥并不能?chē)?yán)格地區(qū)分出來(lái)[51-55]。生長(zhǎng)椎將提供的信號(hào)整合并且做出反應(yīng)，而這反應(yīng)則通過(guò)細(xì)胞骨架的重排表現(xiàn)出來(lái)[51,52,55]。這些反應(yīng)的本質(zhì)更多體現(xiàn)在生長(zhǎng)

61、椎的功能特性上，而非體現(xiàn)在識(shí)別信號(hào)本身。</p><p>　　神經(jīng)軸導(dǎo)向生長(zhǎng)的機(jī)制與白細(xì)胞的趨藥性以及阿米巴變形蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)非常相似，成神經(jīng)細(xì)胞以及神經(jīng)軸在胚胎“環(huán)境”中通過(guò)特定細(xì)胞結(jié)構(gòu)如神經(jīng)軸生長(zhǎng)椎以及遷移神經(jīng)元導(dǎo)向區(qū)域的形成受到周?chē)盘?hào)引導(dǎo)以“探究”周邊環(huán)境[64]。周?chē)姆肿颖憩F(xiàn)出吸引或者排斥的不同信號(hào)，生長(zhǎng)椎會(huì)對(duì)這些信號(hào)進(jìn)行整合并作出反應(yīng)。對(duì)吸引信號(hào)，生長(zhǎng)椎可能表現(xiàn)為神經(jīng)生長(zhǎng)或者發(fā)生牽引作用，對(duì)排斥信號(hào)，生長(zhǎng)

62、椎可能表現(xiàn)為生長(zhǎng)椎的崩塌和回縮。</p><p><b>　　2、主要的導(dǎo)向分子</b></p><p>　　許多分子參與到這種導(dǎo)向中，包括生長(zhǎng)促進(jìn)因子、細(xì)胞粘附因子（CAMs）以及胞外基質(zhì)分子（ECMs）。除了這些分子，在基因、生化以及分子途徑中也發(fā)現(xiàn)了四種保守家族引導(dǎo)信號(hào)分子：神經(jīng)生長(zhǎng)因子（netrins）、裂縫蛋白（Slits）、腦信號(hào)蛋白以及Eph配體。其中一

63、種或者幾種的受體也被發(fā)現(xiàn)了，包括結(jié)直腸癌缺失DCC（Unc40）與UNC-5、Robo、神經(jīng)纖維網(wǎng)格蛋白、叢狀蛋白以及Ephs[65]。</p><p>　?。?）Netrin家族及其受體</p><p>　　R.y. Cajal[62]發(fā)現(xiàn)作為基礎(chǔ)神經(jīng)軸導(dǎo)向機(jī)制的化學(xué)誘導(dǎo)分子：Netrin，最初它被描述為“導(dǎo)向的分子”。有研究表明，Netrins無(wú)論在胚胎CNS發(fā)育過(guò)程中還是CNS損傷修

64、復(fù)中都是廣泛存在的神經(jīng)誘向因子[63]。大多數(shù)Netrin家族成員是可以控制神經(jīng)元和生長(zhǎng)椎遷移的分泌蛋白[64]。這些蛋白是雙功能信號(hào)分子，其中一些是神經(jīng)元的化學(xué)誘導(dǎo)因子，一些是神經(jīng)元的化學(xué)抑制因子。Netrins通過(guò)與兩個(gè)蛋白家族DCC以及UNC-5中的特定蛋白相互作用以發(fā)揮其功能。DCC/UNC-40既可以調(diào)節(jié)吸引反應(yīng)，也可以調(diào)節(jié)拮抗反應(yīng)，然而UNC-5僅發(fā)現(xiàn)可以調(diào)節(jié)拮抗反應(yīng)[65,66]。哺乳動(dòng)物研究表明DCC自身可以調(diào)節(jié)吸引作用

65、，而DCC和UNC-5一同可以調(diào)節(jié)拮抗作用[67]。對(duì)蠕蟲(chóng)的神經(jīng)研究表明DCC和UNC-5單獨(dú)作用也可以調(diào)節(jié)拮抗作用[68]。對(duì)果蠅的研究表明UNC-5單獨(dú)作用可調(diào)節(jié)短程拮抗作用，然而UNC-5和DCC一起可以調(diào)節(jié)長(zhǎng)距離的拮抗作用[69]。Netrin-1通過(guò)DCC激活Cdc42和Rac1，并且通過(guò)Cdc42形成絲狀偽足，在HEK293細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞系NG108-15中</p><p>　?。?）Semap

66、horins家族</p><p>　　Semaphorins導(dǎo)向蛋白家族是一類(lèi)或?yàn)榉置谛突驗(yàn)榭缒ば偷奶堑鞍?它們的N 端都含有 532個(gè)氨基酸殘基組成的- sema區(qū)保守序列。該家族成員中 Semaphorin-1和 collapsin-1最早被發(fā)現(xiàn)。 Sema I是一種跨膜蛋白，它在蚱蜢的胚胎發(fā)育中起到了引導(dǎo)周邊神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的作用[56]。鼠和人的Sema III是研究較多的分泌型信號(hào)素，它們?cè)诩顾韪箓?cè)（除底伴

67、外）的細(xì)胞和大腦中都有高水平的表達(dá) 。</p><p>　　Semaphorins導(dǎo)向蛋白家族最早是發(fā)現(xiàn)它的功能與軸突有關(guān)，該蛋白家族可以影響軸突的拉伸與收縮、分枝、導(dǎo)向生長(zhǎng)以及突觸形成的過(guò)程。軸突發(fā)育的不同層面上會(huì)有不同的 Semaphorin蛋白發(fā)揮作用，并且該蛋白的作用常常是高度特異的負(fù)調(diào)節(jié)。除了神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育方面該蛋白家族會(huì)發(fā)揮作用外，研究表明SemaIII還可以在幾種不同組織的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，并且該蛋

68、白在發(fā)育過(guò)程中還可作為心臟發(fā)育的的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子[57,58]。</p><p>　　（3）Ephrins家族</p><p>　　Slit分子是發(fā)現(xiàn)的第一種對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)以及神經(jīng)元遷移均有導(dǎo)向作用的分子[59,60]。Slits是發(fā)育期脊髓中線膠質(zhì)細(xì)胞以及中隔組織分泌的一組相對(duì)分子量為170-190KD的分泌型蛋白質(zhì)[59]。Slit分子對(duì)軸突生長(zhǎng)起到了排斥性的導(dǎo)向生長(zhǎng)作用。神經(jīng)中線細(xì)胞所分泌

69、的作為排斥信號(hào)的導(dǎo)向生長(zhǎng)分子Slits蛋白會(huì)和表達(dá)在這些軸突表面的受體相互作用，這種相互作用可以決定這些軸突是否穿過(guò)中線，從而阻止已經(jīng)穿過(guò)中線的軸突再次返回中線而發(fā)生中線的來(lái)回穿越現(xiàn)象 [61]。Slit分子也可促進(jìn)其背根神經(jīng)節(jié)軸突的延伸和分支的過(guò)程，同時(shí)它還可以抑制化學(xué)趨向因子驅(qū)使的白細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。</p><p>　　3、電場(chǎng)與導(dǎo)向生長(zhǎng)的關(guān)系</p><p>　　研究電場(chǎng)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響

70、可以給神經(jīng)損傷的修復(fù)提供理論和方法上的支持。從現(xiàn)在的研究上看，在神經(jīng)修復(fù)的過(guò)程中，加載電場(chǎng)刺激可以促進(jìn)人工移植的神經(jīng)突起導(dǎo)向延伸。神經(jīng)損傷后，軸突會(huì)斷裂，如果電場(chǎng)刺激能促進(jìn)軸突的延伸和正確導(dǎo)向連接，那么對(duì)損傷后的神經(jīng)再生將具有重大意義。但是電場(chǎng)刺激對(duì)神經(jīng)突起的導(dǎo)向生長(zhǎng)機(jī)制還不明確，因此研究電場(chǎng)刺激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞導(dǎo)向生長(zhǎng)的影響十分重要。神經(jīng)軸的導(dǎo)向生長(zhǎng)與其生長(zhǎng)椎密切相關(guān)，生長(zhǎng)椎的延伸方向決定了神經(jīng)軸延伸的方向。許多化學(xué)分子會(huì)參與到神經(jīng)細(xì)胞的遷

71、移過(guò)程中，神經(jīng)導(dǎo)向分子（Netrin）是其中非常重要的一種化學(xué)分子。這種分子能吸引或排斥神經(jīng)軸生長(zhǎng)椎，從而引導(dǎo)生長(zhǎng)椎的生長(zhǎng)方向。然而Netrin對(duì)生長(zhǎng)椎的引導(dǎo)作用的實(shí)現(xiàn)需要其受體的存在，結(jié)腸癌缺失（DCC）是Netrin的一個(gè)非常重要的受體，它能與Netrin相互作用，參與神經(jīng)軸的形成，引導(dǎo)神經(jīng)軸的導(dǎo)向生長(zhǎng)。因此對(duì)電場(chǎng)刺激的大腦皮層細(xì)胞進(jìn)行DCC分子表達(dá)檢測(cè)就能從一定程度上檢測(cè)出大腦皮層細(xì)胞在電場(chǎng)的作用下其神經(jīng)軸的導(dǎo)向生長(zhǎng)情況，為神經(jīng)損

72、傷修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。</p><p>　　神經(jīng)損傷修復(fù)需要神經(jīng)元的再生、神經(jīng)元朝向損傷處的遷移以及損傷區(qū)域神經(jīng)軸與靶標(biāo)之間建立聯(lián)系。電場(chǎng)會(huì)對(duì)神經(jīng)的導(dǎo)向生長(zhǎng)（遷移）產(chǎn)生影響，而神經(jīng)元的遷移還會(huì)受到其他多種因素的影響，其中體內(nèi)的化學(xué)分子可以引導(dǎo)神經(jīng)向不同方向遷移。如果電場(chǎng)對(duì)神經(jīng)遷移的影響與體內(nèi)化學(xué)分子對(duì)神經(jīng)遷移的影響一致則可以從一定程度說(shuō)明電場(chǎng)的刺激可能導(dǎo)致這些化學(xué)分子刺激神經(jīng)發(fā)生神經(jīng)導(dǎo)向生長(zhǎng)。</p>

73、<p><b>　　研究目的</b></p><p>　　神經(jīng)元和神經(jīng)軸是神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，但是神經(jīng)元以及神經(jīng)軸的損傷對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的實(shí)現(xiàn)造成了很大的困難，所以怎樣實(shí)現(xiàn)損傷的神經(jīng)元以及神經(jīng)軸的恢復(fù)是一項(xiàng)非常重要的課題，神經(jīng)功能的恢復(fù)在很大程度上依賴于神經(jīng)軸的生長(zhǎng)以及突觸的重新建立，有研究表明神經(jīng)軸的生長(zhǎng)以及突觸的重新建立依賴于神經(jīng)導(dǎo)向生長(zhǎng)過(guò)程。在眾多實(shí)現(xiàn)損傷神經(jīng)恢復(fù)功能

74、的方法中，電刺激是近年來(lái)提出的比較可行的方法，但是電刺激對(duì)神經(jīng)軸生長(zhǎng)的機(jī)制并不清楚，神經(jīng)軸生長(zhǎng)以及突觸的建立是否與神經(jīng)導(dǎo)向生長(zhǎng)相關(guān)也沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)支持。</p><p>　　本研究通過(guò)對(duì)皮層細(xì)胞進(jìn)行電場(chǎng)加載并檢測(cè)神經(jīng)突起的延伸變化以及神經(jīng)導(dǎo)向受體DCC的分子基因表達(dá)，以此分析電場(chǎng)刺激對(duì)神經(jīng)軸突遷移的影響，為神經(jīng)損傷修復(fù)在理論和方法上提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。</p><p><b>　　論文構(gòu)

75、成及研究?jī)?nèi)容</b></p><p>　　本文分為 4個(gè)章節(jié)，除了第一章的緒論外，第二章介紹了實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)原代皮層神經(jīng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)提出了切實(shí)可行的操作流程，對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞加載電場(chǎng)對(duì)其進(jìn)行電刺激觀察細(xì)胞形態(tài)以及基因表達(dá)情況詳細(xì)敘述了實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)過(guò)程、實(shí)驗(yàn)步驟以及實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題。第三章是實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，在這一章中，給出了成功培養(yǎng)原代神經(jīng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)圖、列出了部分成功的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并且講述了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處

76、理方法，針對(duì)每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理均分析了結(jié)果。最后一章是結(jié)論和展望，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞體外原代培養(yǎng)的方法給予了肯定，綜合第二章和第三章對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了總結(jié)并針對(duì)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提出了今后實(shí)驗(yàn)發(fā)展的方向。</p><p>　　本課題研究?jī)?nèi)容主要包括： 1、大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)：采用原代培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)出生當(dāng)天的新生SD大鼠乳鼠進(jìn)行大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定。2、電場(chǎng)加載實(shí)驗(yàn)：采用電場(chǎng)刺激儀，利用鉑電極對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行電刺激

77、，分別檢測(cè)0mv, 50mv，100mv作用2h、4h后，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。刺激后的細(xì)胞，進(jìn)行多聚甲醛固定后，采用免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)β-tublin III，觀察神經(jīng)突起的延伸變化。3、RT-PCR檢測(cè)DCC分子：對(duì)刺激后的細(xì)胞進(jìn)行Trizol裂解后再RNA提取，對(duì)DCC分子基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)其基因表達(dá)水平。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)材料和方法</b></p>

78、;<p><b>　　實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)藥品</b></p><p>　　DMEM高糖培養(yǎng)基（DMEM，碳酸氫鈉，HEPES，硫酸鏈霉素，青霉素），0.25%胰酶-EDTA消化液，胎牛血清，4%多聚賴氨酸包被液，4%多聚甲醛固定液，PBS洗液，阿糖胞苷溶液，一抗（兔抗tubulin-Ⅲ單克隆抗體

79、），二抗（驢抗兔Cy2），DAPI 染液。雙蒸水， 75%乙醇溶液，快速制冷劑。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)器材</b></p><p>　　二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO-15AC，SANYO）、超凈工作臺(tái)（JJ-CJ-ZP潔凈工作臺(tái)，吳江市凈化設(shè)備總廠）、臺(tái)式離心機(jī)（TDL-40B，飛鴿牌）、熒光顯微鏡（Olympus MT-2;Nikon）、Rocking sha

80、ker （TS-92，QILINBEIER）、恒溫磁力攪拌器（81-2型，上海司樂(lè)儀器廠）、電子分析天平（AL104，Mettler Toledo）、照相體視顯微鏡（XTL-Ⅱ型，北京電子光學(xué)設(shè)備廠）、microplate reader（Model 680，BIO-RAD）、酸度計(jì)（PH510，Cyberscan）、立式自動(dòng)電熱壓力蒸氣滅菌器（LDZX-40BI，上海申安醫(yī)療器械廠）、冰箱（BCD-278A/C，Haier）、烘箱（天津

81、市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐公司）、培養(yǎng)板（24孔，96孔）、培養(yǎng)皿（35 mm）、燒杯（1000 ml）、移液器、槍頭、酒精燈、眼科剪、鑷子、手術(shù)器械、離心管、量筒、洗瓶、廢液缸、載玻片、蓋玻片。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物</b></p><p>　　SD大鼠乳鼠（出生12h以內(nèi)），由北醫(yī)動(dòng)物中心提供</p><p>　　大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞原代培

82、養(yǎng)</p><p>　　采用原代培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)出生當(dāng)天的新生SD大鼠乳鼠進(jìn)行大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定。主要流程如下：</p><p><b>　　手術(shù)器械的高壓消毒</b></p><p>　　將分離取腦過(guò)程中所需手術(shù)器械（鑷子，手術(shù)剪，眼科剪，勺子，），10 cm玻璃培養(yǎng)皿，細(xì)胞過(guò)濾器，紗布，15 ml離心管，50 ml離心管，各種型號(hào)

83、槍頭用雙蒸水洗凈后，用報(bào)紙包嚴(yán)，置于高壓蒸汽滅菌鍋中120攝氏度，20min高壓滅菌消毒，培養(yǎng)皿需用酒精浸泡并且同時(shí)進(jìn)行紫外光照射至少三個(gè)小時(shí)以徹底消毒。</p><p>　　DMEM高糖培養(yǎng)基過(guò)濾滅菌</p><p>　　用電子分析天平稱取碳酸氫鈉2g，HEPES 2g，硫酸鏈霉素粉末0.1g，青霉素粉末0.1g，取Gibco公司高糖DMEM培養(yǎng)基一袋加雙蒸水至1L后用恒溫磁力攪拌器攪拌

84、至固體物質(zhì)完全溶解，調(diào)節(jié)PH至7.4。</p><p>　　于超凈間內(nèi)用0.2 μm過(guò)濾器過(guò)濾已配置好的培養(yǎng)基。</p><p><b>　　細(xì)胞培養(yǎng)流程</b></p><p>　?。?）4%多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿過(guò)夜（3h以上）</p><p>　　（2）吸盡培養(yǎng)板內(nèi)多聚賴氨酸，等待晾干后接種細(xì)胞</p&

85、gt;<p>　?。?）取兩個(gè)小培養(yǎng)皿，置于制冷劑上，各加入無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基2-3 ml</p><p>　　（4）用75%酒精消毒乳鼠后，于超凈臺(tái)內(nèi)取其腦置于其中一個(gè)小培養(yǎng)皿中</p><p>　?。?）取大鼠乳鼠腦組織前額葉并置于另一小培養(yǎng)皿中</p><p>　?。?）用鑷子輕輕剝離已取好的腦組織外的腦膜，吸去原有培養(yǎng)基后剪碎腦組織，為消化

86、做準(zhǔn)備</p><p>　　（7）加入3 ml含有1：1的0.02%EDTA：0.25%胰酶的消化液于已剪碎的腦組織中，用封口條密閉小培養(yǎng)皿并置于37℃恒溫箱中20-25 min，并且每五分鐘晃動(dòng)培養(yǎng)皿促進(jìn)消化過(guò)程的進(jìn)行。</p><p>　?。?）取出小培養(yǎng)皿，于超凈臺(tái)內(nèi)開(kāi)蓋，加入3ml已含20%血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，即刻將其移入15 ml離心管內(nèi)，繼續(xù)加入培養(yǎng)基并吹打終止消化（

87、注意防止氣泡的產(chǎn)生且動(dòng)作盡量輕柔，防止細(xì)胞損傷嚴(yán)重）</p><p>　?。?）用0.2 nm的濾膜過(guò)濾所得細(xì)胞懸浮液后以1500 rpm離心5 min</p><p>　　（10）吸出離心管上層培養(yǎng)基后加入1ml新培養(yǎng)基并吹打使沉淀的細(xì)胞團(tuán)分散，繼續(xù)加入培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至接種密度約108</p><p>　?。?1）將細(xì)胞接種入已經(jīng)鋪被有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板，并用蒸餾

88、水加滿四周未接種細(xì)胞的空孔（主要用于減緩培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中的蒸發(fā)）</p><p>　　（12）將接種好細(xì)胞的培養(yǎng)板置于5% CO2，37℃恒溫箱中培養(yǎng)，約2小時(shí)后在培養(yǎng)板中加入含20%血清的DMEM</p><p>　?。?3）第三天加入阿糖胞苷（終濃度為10 μM）</p><p>　　（14）根據(jù)培養(yǎng)基的情況，不定期換液（含10%血清的DMEM）。</p&

89、gt;<p><b>　　電場(chǎng)加載實(shí)驗(yàn)</b></p><p>　　采用電場(chǎng)刺激儀，利用鉑電極對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行電刺激，分別以電壓0mv, 50mv，100mv作用2h、4h后觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。</p><p>　?。?）原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞在培養(yǎng)第七天即上裝置進(jìn)行電刺激實(shí)驗(yàn)</p><p>　?。?）將電刺激實(shí)驗(yàn)中所需要用到的鑷子

90、、鉑電極放入鋁盒中，高壓滅菌121℃20分鐘</p><p>　?。?）準(zhǔn)備滅菌的鋁盒（鑷子、電極）、膠布、剪刀，超凈臺(tái)紫外光照射30分鐘</p><p>　?。?）將鉑電極如圖放置在細(xì)胞培養(yǎng)槽中，連上電極對(duì)其進(jìn)行電刺激實(shí)驗(yàn)</p><p><b>　　免疫熒光染色</b></p><p>　　對(duì)刺激后的細(xì)胞進(jìn)行多聚甲醛

91、固定后，采用免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)βtublin-III，觀察神經(jīng)突起的延伸變化。</p><p><b>　　準(zhǔn)備細(xì)胞</b></p><p>　　按皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)流程，將2ml的神經(jīng)細(xì)胞懸浮液接種于內(nèi)置4片小玻片的35 mm平皿上（玻片及平皿在接種神經(jīng)元之前均需用4%多聚賴氨酸包被過(guò)夜），置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)。在神經(jīng)元培養(yǎng)的第三天，向小平皿中直接加入阿糖胞苷溶液2

92、0 μl（保證其終濃度為10 μM），繼續(xù)置于37攝氏度恒溫箱中培養(yǎng)。第七天做免疫熒光染色。</p><p><b>　　染色流程</b></p><p>　?。?）在培養(yǎng)的第七天，取出小平皿的內(nèi)置小玻片，移入24孔板內(nèi)（每孔一個(gè)小玻片），長(zhǎng)有神經(jīng)元的一面朝上</p><p>　　（2）每孔加入300 μlPBS溶液，輕輕振蕩后吸去所加入的PB

93、S溶液，重復(fù)三次，洗去小玻片上原有培養(yǎng)基</p><p>　?。?）每孔加入4%多聚甲醛300 μl，固定細(xì)胞15 min</p><p>　　（4）洗去甲醛溶液，同步驟2，PBS洗三次，洗去殘留的甲醛溶液</p><p>　?。?）加入200 μl 10%血清（需與二抗同源，本實(shí)驗(yàn)中為驢血清）封閉非特異性位點(diǎn)</p><p>　?。?）吸去

94、血清溶液，PBS漂洗3次后，每孔加入200 μl一抗（兔抗tubulin-Ⅲ單克隆抗體）（用加有3%Tritons的PBS溶液稀釋一抗，本實(shí)驗(yàn)中所用的稀釋比例為1：1000）后，室溫靜置2h或置于4℃冰箱過(guò)夜</p><p>　　（7）吸去一抗溶液，并用PBS洗三次（每次均需將24孔培養(yǎng)板置于搖床上振蕩3-5min）</p><p>　?。?）每孔加入200 μl二抗（驢抗兔cy2）溶液（

95、直接用PBS稀釋即可，本實(shí)驗(yàn)所用稀釋比例為1：500），避光保存1-2 h</p><p>　?。?）吸去二抗溶液，并用PBS洗三次（每次均需將24孔培養(yǎng)板置于搖床上振蕩3-5min）</p><p>　?。?0）往各小玻片上直接滴加10 μl的DAPI溶液染核幾分鐘</p><p>　?。?1）取一載玻片，于其上滴一滴加有甘油的PBS溶液（甘油與PBS一比一混合）

96、，將24孔板內(nèi)小玻片取出，長(zhǎng)有細(xì)胞的一面朝下扣在混合溶液上</p><p>　?。?2）將已制好的標(biāo)本置于熒光鏡下觀察</p><p>　　FDA（Fluorescein diacetate 乙酰熒光素）染色</p><p><b>　　配制染色所需的試劑</b></p><p>　?。?）如表2.1配制FDA溶液（5m

97、g/ml）</p><p>　　表2.1 FDA溶液配制</p><p>　　溶解了的FDA溶液置于-20℃保存</p><p>　?。?）如表2.2配制HBSS（1L）溶液</p><p>　　表2.2 HBSS溶液配制</p><p>　　配制好HBSS溶液后需進(jìn)行除菌過(guò)濾操作，用濾器對(duì)配制好的溶液進(jìn)行過(guò)濾<

98、/p><p><b>　　染色步驟</b></p><p>　?。?）20ul的5mg/ml FDA加入10ml HBSS溶液稀釋</p><p>　?。?）將配制好的溶液滴入細(xì)胞樣品中</p><p>　?。?）3-5min后將樣品在熒光顯微鏡下觀察</p><p>　　RT-PCR檢測(cè)DCC分子&

99、lt;/p><p>　　對(duì)刺激后的細(xì)胞進(jìn)行Trizol裂解后再RNA提取，對(duì)DCC分子基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)其基因表達(dá)水平。</p><p>　　RT-PCR是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶的鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)。這個(gè)過(guò)程首先要經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶的作用將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，以獲取cDNA片段，再以cDNA為模板以此復(fù)制合成目的片段。RT-PCR技術(shù)的用途非常

100、廣泛，它可以用于直接克隆特定基因的cDNA片段、也可以用于檢測(cè)細(xì)胞中RNA的含量和細(xì)胞中基因表達(dá)的水平。作為模板的RNA可以是細(xì)胞中的總RNA或者是mRNA，甚至可以是體外轉(zhuǎn)錄的RNA。無(wú)論使用的RNA是哪種類(lèi)型，關(guān)鍵是要確保使用的RNA中沒(méi)有RNA酶和基因組 DNA的污染，所以需要在過(guò)程中除去RNA酶和DNA。本實(shí)驗(yàn)采用皮層神經(jīng)細(xì)胞的總RNA作為模板進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。</p><p><b>　　

101、總RNA的提取</b></p><p>　　（1）用500ul Trizol處理細(xì)胞，充分裂解，將裂解液移至EP管中；</p><p>　?。?）加入100uL氯仿（三氯甲烷），劇烈震蕩15s，室溫放置5min；</p><p>　?。?）4℃，12000rpm，離心15min，取上層水相，置于另一個(gè)1.5ml EP管中；</p><

102、p>　?。?）加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫放置10min；</p><p>　?。?）4℃，12000rpm，離心15min，棄上清，加入冰浴預(yù)冷的75%乙醇500μl（DEPC水配制）清洗；</p><p>　?。?）4℃，12000rpm，離心5min，棄上清，自然風(fēng)干8-10min；</p><p>　?。?）加入20μl DEPC水溶解沉淀，

103、用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，用A260/A280吸光度比值判斷RNA純度。</p><p>　　注意事項(xiàng)：防止RNA酶污染的措施:</p><p>　?。?）所有使用的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6h或更長(zhǎng)時(shí)間。塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡，有機(jī)玻璃的電泳槽可先用酸洗液和去污劑進(jìn)行洗滌，并用雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 中10min，然后用0.1%

104、 DEPC水沖洗并晾干之。</p><p>　?。?）所有體系中的溶質(zhì)應(yīng)盡可能在37℃用0.1% DEPC處理12hr以上，然后再用121℃高壓滅菌20min除去殘留的DEPC水。不能用高壓高溫滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.2μm濾膜過(guò)濾除菌。</p><p>　?。?0）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要佩戴一次性口罩以防止唾液中的RNA酶對(duì)RNA的作用，也要戴手套并且實(shí)驗(yàn)過(guò)程

105、中手套要勤換。所有的器械等應(yīng)設(shè)置為RNA專(zhuān)用，這樣才能從更大程度上降低RNA酶等其他物質(zhì)的污染。</p><p><b>　　反轉(zhuǎn)錄合成cDNA</b></p><p><b>　?。?）RT-1:</b></p><p>　　如表2.3配制反轉(zhuǎn)錄體系</p><p>　　表2.3 反轉(zhuǎn)錄體系1&l

106、t;/p><p>　　用DEPC水補(bǔ)至總體積為 15.25μl</p><p>　　低速離心混勻，使液體集中于EP管底部。置于PCR儀中，設(shè)置程序：72℃，5min；4℃，5min；</p><p><b>　?。?）RT-2：</b></p><p>　　配制反轉(zhuǎn)錄體系，每份樣品按表2.4加樣：</p>&l

107、t;p>　　表2.4 反轉(zhuǎn)錄體系2</p><p>　　低速離心混勻，使液體集中于EP管底部。置于PCR儀中，設(shè)置程序：58℃，60min；94℃，5min；</p><p>　　每管加入30μl滅菌蒸餾水，混勻，分裝成兩份，分別保存于4℃和-20℃。</p><p>　　RT-PCR注意事項(xiàng):DEPC處理</p><p>　　DEPC

108、水：100ml超純水加入0.2ml DEPC，充分混勻，高壓滅菌。</p><p>　　Tip頭(槍頭）、EP管等在提RNA過(guò)程中及做RT時(shí)接觸RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip頭、EP管和PCR反應(yīng)管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超純水加入1ml DEPC）37℃浸泡過(guò)夜，高壓滅菌。</p><p><b>　　PCR反應(yīng)</b>&

109、lt;/p><p>　　表2.5 GAPDH和DCC的PCR引物</p><p>　　如表2.6配制20μl的PCR反應(yīng)體系：</p><p>　　表2.6 PCR體系</p><p>　　用滅菌蒸餾水補(bǔ)足至20μl；</p><p>　　低速離心混勻，使液體集中于EP管底部；置于PCR儀中，設(shè)置程序：94℃，5min（預(yù)