催產(chǎn)素誘導(dǎo)P19細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：心肌梗死患者的干細(xì)胞移植治療能夠取代壞死的心肌細(xì)胞、增加有功能的心肌細(xì)胞數(shù)量，從而達(dá)到改善心功能的目的，是一種理想的治療手段。目前，干細(xì)胞治療還處于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究和初期的臨床研究階段，是全球心血管疾病研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。P19胚胎癌細(xì)胞是目前研究較成熟的一種胚胎源性干細(xì)胞，深受廣大干細(xì)胞研究者青睞。催產(chǎn)素(Oxytocin，OT)長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為只是一種女性生殖激素，然而，近年來(lái)隨著其多方面作用的發(fā)現(xiàn)，逐漸被越來(lái)越多的研究人員所重視。近

2、年的研究發(fā)現(xiàn)，OT還具有促進(jìn)心臟發(fā)生的作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用OT作用于培養(yǎng)的P19胚胎源性干細(xì)胞，誘導(dǎo)其向心肌細(xì)胞方向分化，并通過免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)、透射電子顯微鏡技術(shù)等方法對(duì)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，以期為心肌損傷干細(xì)胞治療提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 方法：1P19細(xì)胞誘導(dǎo)分化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P19細(xì)胞，經(jīng)0.25％胰酶-0.2％EDTA消化，制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml，以每皿2ml接種于0.5

3、％瓊脂鋪底的直徑35mm細(xì)菌級(jí)培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組1、2、3的培養(yǎng)基中分別含OT1×10-7mol/L、3×10-7mol/L、5×10-7mol/L；對(duì)照組的培養(yǎng)基中不含OT。 懸浮培養(yǎng)24小時(shí)后，即可見多個(gè)懸浮的細(xì)胞團(tuán)形成。懸浮培養(yǎng)4天后，細(xì)胞團(tuán)體積增大，成為球形類胚體(embryonicbody，EB)樣結(jié)構(gòu)。分別將各組EB接種至內(nèi)含蓋玻片的直徑60mm組織培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)。每日于倒置相差顯微鏡下觀察EB生長(zhǎng)分化情況。

4、共培養(yǎng)14-16天后，收集細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。 2免疫細(xì)胞化學(xué)染色取誘導(dǎo)14-16天的細(xì)胞爬片，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞中橫紋肌肌動(dòng)蛋白α(α-actin)、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)的表達(dá)情況，并計(jì)算各組單層生長(zhǎng)暈中陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。 3激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)取誘導(dǎo)14-16天的細(xì)胞爬片，采用α-actin標(biāo)紅色熒光、cTnT標(biāo)綠色熒光進(jìn)行熒光雙重標(biāo)記染色觀察。 4透射電鏡技術(shù)取誘導(dǎo)14-16天

5、的細(xì)胞爬片，常規(guī)固定、脫水、浸透后，刮下周圍生長(zhǎng)暈的細(xì)胞，置于包埋板底部包埋，再經(jīng)聚合、切片、染色、透射電鏡觀察誘導(dǎo)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：1P19細(xì)胞誘導(dǎo)分化動(dòng)態(tài)觀察P19細(xì)胞在瓊脂鋪底的細(xì)菌級(jí)培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)，24小時(shí)后即可見多個(gè)懸浮的細(xì)胞團(tuán)形成。細(xì)胞團(tuán)呈球形，形狀較規(guī)則，直徑隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷增大，至第4天，形成球形EB樣結(jié)構(gòu)。倒置相差顯微鏡下觀察可見各實(shí)驗(yàn)組EB樣結(jié)構(gòu)形狀規(guī)則、體積較大，直徑約為1-1.5mm；位于EB中央的細(xì)

6、胞密集、顏色較深，為EB的內(nèi)核。EB開始貼壁生長(zhǎng)后，中央細(xì)胞多層排列，增殖速度較快，細(xì)胞體積較小，具有高核質(zhì)比，為未分化細(xì)胞；由EB邊緣逐漸爬出細(xì)胞，在周邊形成單層的生長(zhǎng)暈。細(xì)胞生長(zhǎng)暈中一些細(xì)胞變形，胞體伸長(zhǎng)，體積增大，細(xì)胞呈放射狀排列。對(duì)照組EB結(jié)構(gòu)體積較小，直徑約為0.5-1mm。EB貼壁生長(zhǎng)后，細(xì)胞生長(zhǎng)暈中無(wú)明顯的變形細(xì)胞。 2免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組EB邊緣生長(zhǎng)暈中變形的細(xì)胞表達(dá)α-actin和cTnT。對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)暈中

7、無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組1、2、3的單層生長(zhǎng)暈中α-actin陽(yáng)性率分別為65.8％、55.4％、31％，以實(shí)驗(yàn)組1最高；cTnT陽(yáng)性率分別為49％、39.6％、12％，也以實(shí)驗(yàn)組1最高。 3激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果在激光的激發(fā)下，各實(shí)驗(yàn)組EB邊緣生長(zhǎng)暈的部分細(xì)胞胞質(zhì)中有α-actin表達(dá)的連接通道呈紅色絲狀免疫熒光標(biāo)記，有cTnT表達(dá)的連接通道呈綠色絲狀免疫熒光標(biāo)記，當(dāng)兩者同時(shí)被觀察時(shí)可見其重疊的部位變成黃色，表明該細(xì)胞中有

8、心肌肌絲形成。 4透射電鏡觀察結(jié)果實(shí)驗(yàn)細(xì)1的誘導(dǎo)細(xì)胞最接近心肌細(xì)胞，具有心肌細(xì)胞發(fā)育早期的特征：細(xì)胞核呈卵圓形；細(xì)胞器豐富，有較多的線粒體、高爾基體和核糖體；細(xì)胞質(zhì)中有含量不等的成束肌絲。肌絲束排列不規(guī)則，尚未形成肌節(jié)樣結(jié)構(gòu)。細(xì)胞之間可見分布廣泛的連接復(fù)合體，包括中間連接、縫隙連接及發(fā)育早期的橋粒。部分細(xì)胞連接的胞質(zhì)側(cè)可見較多的肌絲成粗大的束狀。部分細(xì)胞之間可見類似早期閏盤樣結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞周邊伸出大小、形狀不一的指狀突起，相鄰細(xì)胞

9、的突起交錯(cuò)相嵌，突起內(nèi)或周邊可見較多微絲，微絲伸入胞質(zhì)深部可形成終末網(wǎng)。 結(jié)論：1采用誘導(dǎo)劑OT處理與懸浮聚集培養(yǎng)結(jié)合的方法，先形成EB樣結(jié)構(gòu)，再將EB貼壁培養(yǎng)，可促進(jìn)P19細(xì)胞分化。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色、激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)及透射電子顯微鏡技術(shù)觀察誘導(dǎo)分化的細(xì)胞，證明OT具有誘導(dǎo)P19細(xì)胞向心肌細(xì)胞方向分化的能力。 2針對(duì)本實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)，改良培養(yǎng)細(xì)胞的透射電鏡樣品制備方法。應(yīng)用透射電鏡觀察誘導(dǎo)分化的細(xì)胞具有早期發(fā)育的心