PI3K催化亞基p110α和S6K1在小鼠受精卵早期發(fā)育中作用的研究.pdf

1、磷脂酰肌醇—3—激酶(PI3Ks)是參與酪氨酸激酶受體介導的信號傳導酯激酶，由三類復雜的家族成員組成，每一類有多個亞單位和亞型。PI3Kα是這個家族中研究最多的一種酶，它是具有接頭功能的異源二聚體蛋白，由一個催化亞基(p110α)和一個85kDa的調(diào)節(jié)亞基(p85α)組成。PI3K信號傳導通路是細胞生長、增殖、存活、腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)因子。許多文獻已提示PI3K在許多類型細胞周期進程中起中樞調(diào)控作用，PI3K不僅在G1/S期轉(zhuǎn)換時起作用，還

2、可能調(diào)節(jié)G2/M期轉(zhuǎn)換效率，但是在此進程中PI3K亞型的特異作用尚未詳盡闡釋。目前有關PI3K在哺乳動物受精卵早期發(fā)育過程中作用報道仍然很少。盡管已有文獻報道PI3K可能在前植入胚泡中調(diào)控細胞的葡萄糖代謝，但是P13K各亞型在胚胎發(fā)育中的生理作用尚未進行深入探討。ⅠA型PI3K的催化亞基p110α不僅在果蠅的細胞生長中起作用，而且在小鼠的早期胚胎發(fā)育中也起重要作用。但該作用的機制是什么，從何時開始發(fā)揮尚不清楚。在過去的十幾年中，很多學者

3、進行了PI3K/ Akt(蛋白激酶B/PKB)通路廣泛的研究，研究提示該通路在細胞的遷移、有絲分裂發(fā)生、分化、細胞存活中起到關鍵調(diào)節(jié)子的作用。一些結(jié)果顯示Akt在哺乳動物細胞的周期進展中促進G2/M期轉(zhuǎn)換，然而尚未完全了解P13K/Akt信號通路的直接聯(lián)系以及它們在G2/M轉(zhuǎn)換中的調(diào)控作用。在分裂的真核細胞中，M期促進因子(MPF)掌控有絲分裂的入口。MPF可能通過磷酸化與去磷酸化cdc2對G2/M轉(zhuǎn)換進行緊密調(diào)節(jié)。 材料與方法

4、： 一、材料與試劑 中國醫(yī)科大學實驗動物部提供昆明系雌性小白鼠；一抗(Santa Cruz)，堿性磷酸酶連接的二抗(Sigma)，ECL發(fā)光試劑盒(Pierce公司)，快速微量mRNA提取純化試劑盒(GE Healthcare UK公司)，RNA PCR Kit(AMV) Ver2.1(Takara公司)。pBJ-P110α—WT，pBJ-P110α—AC，pBJ-P110α—KD由Anke Klippel教授惠贈。PH

5、l-P110α shRNA/control shRNA由Osamu Hazeki教授(Hiroshima University)惠贈。pSUPER—mTOR shRNA，pSUPER—raptor shRNA和pSUPER—rictor shRNA由Estella Jacinto教授惠贈。E.coli DH5α感受態(tài)細菌、氨卞青霉素(Takara公司)，LB培養(yǎng)基(Invitrogen)，UNIQ—10柱式DNA膠回收試劑盒以及質(zhì)粒小量

6、提取試劑盒(上海生工)，去內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒(OMEGA公司)，O—dianidine、β—naphthyl acid phosphate、PKB及MPF活性測定試劑均為Sigrna公司產(chǎn)品。 二、小鼠超排卵及受精卵的采集和培養(yǎng) 三、重組載體的構(gòu)建 四、體外轉(zhuǎn)錄 五、mRNA顯微注射 六、shRNA胞核顯微注射 七、RT-PCR檢測1—細胞期受精卵中p110α、mTOR、 rapto

7、r、rictor和S6K1的mRNA水平 八、Western印跡 九、細胞免疫熒光定位 十、放射自顯影檢測Akt活性和MPF活性 結(jié)果： 一、小鼠受精卵中p110α的表達水平 結(jié)果顯示，與蛋白表達水平一致，p110α在受精后四個期的mRNA水平無明顯差異。 二、p110α在1—細胞期或2—細胞期胚胎中的定位 結(jié)果顯示，p110α定位在卵細胞的細胞膜上。這個結(jié)果說明了在小鼠受

8、精卵的發(fā)育過程中p110α，發(fā)揮作用可能與細胞膜上的蛋白密切相關。 三、 p110α shRNA抑制p110α的表達 為了檢測p110α shRNA是否可以削減內(nèi)源性的p110α蛋白水平，在G1期顯微注射TE、control shRNA或者p110α shRNA的受精卵于M16培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。在20小時的培養(yǎng)后，收集卵細胞進行RT-PCR和Western Blot實驗。結(jié)果顯示1mg/ml的p110αshRNA可以較徹

9、底的抑制內(nèi)源性p110α的表達，而對照組TE與control shRNA注射組則相反。 四、 p110α shRNA和p110α mRNA調(diào)控1—細胞期受精卵的分裂 分別在hCG注射27h和32h后計算每組細胞的分裂率。在對照組，hCG注射后27小時，胚胎未分裂，在hCG后32h，68％的1—細胞胚胎分裂成2—細胞胚胎。三個對照組組間沒有明顯的區(qū)別。與control shRNA處理組的胚胎相比，p110α的沉默明顯抑制1

10、—細胞胚胎的分裂，說明p110α shRNA干擾小鼠1—細胞胚胎的G2/M期轉(zhuǎn)換。顯微注射p110α—WT mRNA的1—細胞期胚胎在hCG注射27h后處于1—細胞階段，在32h后79％的胚胎達到2—細胞階段。顯微注射p110α—AC mRNA的1—細胞期胚胎在32h的分裂率達到90％，并且分裂加速，在27h已有24％的胚胎分裂。在32h可見不規(guī)則分裂。相比，注射hCG32h后，約38％顯微注射p110α—KD mRNA的胚胎進行分裂。

11、顯微注射不同的p110αmRNA，不僅可以調(diào)節(jié)1—細胞胚胎的分裂時程，而且可以調(diào)節(jié)胚胎的分裂率。 五、p110α shRNA和p110α mRNA的顯微注射調(diào)節(jié)Akt和MPF的活性 通過p110α shRNA和各組p110α mRNA顯微注射到胚胎，調(diào)控1—細胞階段的胚胎發(fā)育，提示p110α在調(diào)控小鼠胚胎分裂方面的作用。為進一步研究p110α調(diào)控1—細胞胚胎發(fā)育潛在機制，通過內(nèi)源性p110α的缺失以及p110α三種mRN

12、A的過表達，檢測p110α在Akt和MPF信號通路上的效應。首先，確定1—細胞期胚胎中的內(nèi)源性Akt的激活時程。Akt的活性在hCG注射后27h達到峰值，在28—30hAkt的活性明顯降低。因此我們選擇在hCG注射后26—27h檢測Akt的活性變化。在p110α shRNA顯微注射組與control shRNA對照組相比，Akt的活性明顯降低。在p110α—WT mRNA mRNA顯微注射組，Akt的活性幾乎是對照組活性的2倍；在p11

13、0α—AC mRNA顯微注射組，Akt的活性幾乎是對照組活性的3倍。然而，在p110α—KD mRNA顯微注射組，Akt的活性卻低于對照組的活性。 六、小鼠受精卵各期中S6K1的表達和定位 S6K1的mRNA水平在G1、S、G2、M期似乎沒有什么變化。通過蛋白免疫印跡分析顯示S6K1在小鼠受精卵的各期中70KD的條帶在強度或者移動率方面也沒有什么變化。通過免疫熒光染色分析S6K1的亞細胞定位，顯示代表S6K1的綠色熒光

14、信號主要分布在1—細胞的胞漿中。 七、小鼠受精卵中Thr389位磷酸化的S6K1的表達和定位 Thr389位磷酸化的S6k1可以反映S6K1的活性，通過蛋白印跡實驗檢測Thr389位磷酸化的S6k1表達情況。Thr389磷酸化的S6k1在小鼠受精卵中從G1期到M期一直出現(xiàn)，在G2期和M期的表達明顯增高，灰度值統(tǒng)計分析表明，差異具有顯著性，說明S6K1在整個1—細胞期中是有活性的。既然蛋白的細胞定位在某種程度上反映蛋白的

15、功能，通過免疫熒光染色的方法檢測Thr389磷酸化的S6k1的定位，實驗結(jié)果顯示Thr389位磷酸化的S6k1主要定位在1—細胞胚胎的細胞膜，但是在胞漿仍舊有微弱的染色。 八、raptor和S6K1的共定位 通過用S6K1與raptor抗體的雙染檢測S6K1與raptor的定位是否相關。S6K1的分布與raptor的分布是一致的，二者同時定位在胚胎的胞漿中。 九、 mTORC1對S6K1的Thr389磷酸化起作用

16、 為了檢測哪一型mTOR的復合物對于S6K1的磷酸化是主要的，使用小發(fā)夾RNA干擾的方法抑制mTOR以及它的相關蛋白的表達。結(jié)果顯示mTOR shRNA的顯微注射可以抑制mTOR的轉(zhuǎn)錄，raptor shRNA可以降低raptor的mRNA水平，同理rictor shRNA。在注射pSUPER—mTOR shRNA/raptor shRNA/rictor shRNA的受精卵中β—actin的mRNA水平一致。削減的mTOR或者r

17、aptor的表達，可以強烈的抑制S6K1Thr389的磷酸化，而rictor不能。 結(jié)論： 1、小鼠受精卵第一次有絲分裂過程中p110α分布在1—細胞期和2—細胞期胚胎的細胞膜上，含量卻不變。 2、p110α表達沉默可降低Akt和MPF活性，進而干擾受精卵G2/M期轉(zhuǎn)換，使卵裂率明顯降低。編碼結(jié)構(gòu)活性p110α mRNA比野生型p110α mRNA更有效的促進受精卵的分裂率；激酶失活型p110α mRNA延遲首次