14-3-3蛋白在小鼠一細(xì)胞期受精卵的表達(dá)和定位研究.pdf

1、目的：一個(gè)細(xì)胞周期包含了細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和增殖，對(duì)一個(gè)細(xì)胞周期進(jìn)行研究就能夠揭示某種細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和增殖的過程。細(xì)胞周期一般包含4個(gè)時(shí)期，G1期，即DNA合成前期；S期，即DNA合成期；G2期，即DNA合成后期；M期，即分裂期。14-3-3蛋白是一種高度保守，分子量約28-31KDa的酸性蛋白家族，哺乳動(dòng)物至少有七種基因編碼14-3-3蛋白亞型，而酵母、果蠅以及線蟲則只有兩種[1]。哺乳動(dòng)物14-3-3蛋白亞型種類較多，是目前研究最多

2、的蛋白質(zhì)，共包括七種亞型，分別為ε、β、η、γ、ζ、σ和τ，且各亞型都有其特殊的功能和作用，能夠特異性地與磷酸化絲氨酸或蘇氨酸肽段結(jié)合，參與了多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。14-3-3蛋白參與了細(xì)胞內(nèi)的眾多的重要生命活動(dòng)過程，功能涉及到細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。14-3-3蛋白通常作為一種“接頭蛋白”或“伴侶蛋白”在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)間來回穿梭，以調(diào)節(jié)與之結(jié)合的靶蛋白的功能。Cdc25蛋白家族是一種雙重磷酸酶，包括Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C

3、三種磷酸酶，分別在有絲分裂中發(fā)揮重要作用[2，3]，其中Cdc25B被認(rèn)為在有絲分裂中是最主要的啟動(dòng)者。研究表明Cdc25B蛋白的活性和細(xì)胞定位由14-3-3蛋白調(diào)節(jié)[4,5]。Uchida S等的研究也證實(shí)14-3-3ε與人的Cdc25B的309位被磷酸化的絲氨酸結(jié)合，致使Cdc25B定位于細(xì)胞質(zhì)[6]。對(duì)爪蟾卵母細(xì)胞的研究表明，PKA（protein kinase A）可直接磷酸化Cdc25的287位絲氨酸，此位點(diǎn)磷酸化后導(dǎo)致14-

4、3-3蛋白的結(jié)合，Cdc25活性受到抑制，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯[7-9]。小鼠卵母細(xì)胞的研究表明[10-13]：在小鼠GV期卵母細(xì)胞中PKA磷酸化Cdc25B的321位絲氨酸后與14-3-3ε結(jié)合，二者共定位于細(xì)胞質(zhì)，Cdc25B不能入核使Cdc2的Thr14/Tyr15脫磷酸，因而不能激活MPF,卵母細(xì)胞阻滯于GV期。受精卵和卵母細(xì)胞的發(fā)育是兩個(gè)互相聯(lián)系但又存在差異的過程，所以對(duì)受精卵這一天然的細(xì)胞周期模型進(jìn)行深入研究，將有

5、利于揭示生殖發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)生長(zhǎng)、發(fā)育、癌變、死亡機(jī)理。小鼠受精卵是脊椎動(dòng)物中與人類較為接近的細(xì)胞周期模型，由于取材有限，關(guān)于小鼠受精卵早期發(fā)育的機(jī)制，尤其是一細(xì)胞期向二細(xì)胞期的轉(zhuǎn)化，即G2/M期轉(zhuǎn)換機(jī)制知之甚少，因此也成為當(dāng)今國(guó)際上研究的熱點(diǎn)之一。但是小鼠一細(xì)胞期受精卵中是否表達(dá)14-3-3蛋白以及各亞型的表達(dá)情況目前國(guó)內(nèi)外未見文獻(xiàn)報(bào)道，而且在小鼠受精卵中14-3-3ε和Cdc25B是否存在共定位也知者甚少。本研究應(yīng)用分子生

6、物學(xué)技術(shù)和方法對(duì)小鼠受精卵14-3-3蛋白的表達(dá)亞型進(jìn)行鑒定，確定主要的表達(dá)亞型以期為今后研究14-3-3蛋白調(diào)控小鼠一細(xì)胞期受精卵G2/M轉(zhuǎn)換中作用的研究做前期的準(zhǔn)備工作。
　　方法：1.小鼠超排卵及一細(xì)胞期G1,S,G2,M四個(gè)時(shí)相受精卵的收集。2.運(yùn)用
　　Real-time RT-PCR檢測(cè)受精卵一細(xì)胞期14-3-3蛋白七個(gè)亞型mRNA的相對(duì)表達(dá)量及主要表達(dá)亞型。3.Western blot檢測(cè)四個(gè)時(shí)相的14-3-3

7、ε蛋白的表達(dá)。4.運(yùn)用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀測(cè)14-3-3ε和Cdc25B在小鼠一細(xì)胞期受精卵四個(gè)時(shí)相的亞細(xì)胞共定位情況。
　　結(jié)果：1.14-3-3蛋白七個(gè)亞型在小鼠受精卵第一次有絲分裂四個(gè)時(shí)相mRNA的相對(duì)表達(dá)亞型中只有ε、ζ兩個(gè)亞型的mRNA在四個(gè)時(shí)相的表達(dá)都相對(duì)較高，而β、σ和τ三個(gè)亞型的mRNA四個(gè)時(shí)相的表達(dá)都相對(duì)較低；η在G1期高表達(dá)，在S,G2,M期低表達(dá)；γ亞型在G1期低表達(dá)，在S,G2,M期中度表達(dá)；ε亞型從G1到G

8、2期表達(dá)逐漸增高，到M期略有降低；ζ亞型G1期高表達(dá)，S期表達(dá)大幅下降，而從S期到M期表達(dá)量逐漸升高。2.Western blot檢測(cè)14-3-3ε在小鼠受精卵第一次有絲分裂四個(gè)時(shí)相蛋白的表達(dá)14-3-3ε蛋白在四個(gè)時(shí)相均有表達(dá)，G1到G2期表達(dá)逐漸增加，在G2期表達(dá)最高，在M期表達(dá)有所降低。3.間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀測(cè)14-3-3ε和Cdc25B在小鼠一細(xì)胞期受精卵四個(gè)時(shí)相的亞細(xì)胞共定位14-3-3ε（紅色熒光）和Cdc25B（綠色熒光）

9、在G1期和S期共定位于受精卵的細(xì)胞質(zhì)，在G2前期部分Cdc25B（綠色熒光）進(jìn)入細(xì)胞核，G2后期在核內(nèi)可見綠色熒光的強(qiáng)度明顯加強(qiáng)，在M期14-3-3ε（紅色熒光）和Cdc25B（綠色熒光）均勻的分布于細(xì)胞質(zhì)。
　　結(jié)論：1、在小鼠一細(xì)胞期受精卵中主要表達(dá)亞型為ε和ζ兩個(gè)亞型。2、14-3-3ε蛋白在四個(gè)時(shí)相均有表達(dá)，G1到G2期表達(dá)逐漸增加，在G2期表達(dá)最高，在M期表達(dá)有所降低。3.14-3-3ε和Cdc25B在G1期和S期共定位