14-3-3蛋白在小鼠一細胞期受精卵的表達和定位研究.pdf

1、目的：一個細胞周期包含了細胞的生長、發(fā)育和增殖，對一個細胞周期進行研究就能夠揭示某種細胞的生長、發(fā)育和增殖的過程。細胞周期一般包含4個時期，G1期，即DNA合成前期；S期，即DNA合成期；G2期，即DNA合成后期；M期，即分裂期。14-3-3蛋白是一種高度保守，分子量約28-31KDa的酸性蛋白家族，哺乳動物至少有七種基因編碼14-3-3蛋白亞型，而酵母、果蠅以及線蟲則只有兩種[1]。哺乳動物14-3-3蛋白亞型種類較多，是目前研究最多

2、的蛋白質(zhì)，共包括七種亞型，分別為ε、β、η、γ、ζ、σ和τ，且各亞型都有其特殊的功能和作用，能夠特異性地與磷酸化絲氨酸或蘇氨酸肽段結(jié)合，參與了多種信號轉(zhuǎn)導途徑。14-3-3蛋白參與了細胞內(nèi)的眾多的重要生命活動過程，功能涉及到細胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導。14-3-3蛋白通常作為一種“接頭蛋白”或“伴侶蛋白”在細胞核與細胞質(zhì)間來回穿梭，以調(diào)節(jié)與之結(jié)合的靶蛋白的功能。Cdc25蛋白家族是一種雙重磷酸酶，包括Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C

3、三種磷酸酶，分別在有絲分裂中發(fā)揮重要作用[2，3]，其中Cdc25B被認為在有絲分裂中是最主要的啟動者。研究表明Cdc25B蛋白的活性和細胞定位由14-3-3蛋白調(diào)節(jié)[4,5]。Uchida S等的研究也證實14-3-3ε與人的Cdc25B的309位被磷酸化的絲氨酸結(jié)合，致使Cdc25B定位于細胞質(zhì)[6]。對爪蟾卵母細胞的研究表明，PKA（protein kinase A）可直接磷酸化Cdc25的287位絲氨酸，此位點磷酸化后導致14-

4、3-3蛋白的結(jié)合，Cdc25活性受到抑制，從而導致卵母細胞發(fā)生G2期阻滯[7-9]。小鼠卵母細胞的研究表明[10-13]：在小鼠GV期卵母細胞中PKA磷酸化Cdc25B的321位絲氨酸后與14-3-3ε結(jié)合，二者共定位于細胞質(zhì)，Cdc25B不能入核使Cdc2的Thr14/Tyr15脫磷酸，因而不能激活MPF,卵母細胞阻滯于GV期。受精卵和卵母細胞的發(fā)育是兩個互相聯(lián)系但又存在差異的過程，所以對受精卵這一天然的細胞周期模型進行深入研究，將有

5、利于揭示生殖發(fā)育的調(diào)控機制，進一步認識生長、發(fā)育、癌變、死亡機理。小鼠受精卵是脊椎動物中與人類較為接近的細胞周期模型，由于取材有限，關(guān)于小鼠受精卵早期發(fā)育的機制，尤其是一細胞期向二細胞期的轉(zhuǎn)化，即G2/M期轉(zhuǎn)換機制知之甚少，因此也成為當今國際上研究的熱點之一。但是小鼠一細胞期受精卵中是否表達14-3-3蛋白以及各亞型的表達情況目前國內(nèi)外未見文獻報道，而且在小鼠受精卵中14-3-3ε和Cdc25B是否存在共定位也知者甚少。本研究應用分子生

6、物學技術(shù)和方法對小鼠受精卵14-3-3蛋白的表達亞型進行鑒定，確定主要的表達亞型以期為今后研究14-3-3蛋白調(diào)控小鼠一細胞期受精卵G2/M轉(zhuǎn)換中作用的研究做前期的準備工作。
　　方法：1.小鼠超排卵及一細胞期G1,S,G2,M四個時相受精卵的收集。2.運用
　　Real-time RT-PCR檢測受精卵一細胞期14-3-3蛋白七個亞型mRNA的相對表達量及主要表達亞型。3.Western blot檢測四個時相的14-3-3

7、ε蛋白的表達。4.運用間接免疫熒光實驗觀測14-3-3ε和Cdc25B在小鼠一細胞期受精卵四個時相的亞細胞共定位情況。
　　結(jié)果：1.14-3-3蛋白七個亞型在小鼠受精卵第一次有絲分裂四個時相mRNA的相對表達亞型中只有ε、ζ兩個亞型的mRNA在四個時相的表達都相對較高，而β、σ和τ三個亞型的mRNA四個時相的表達都相對較低；η在G1期高表達，在S,G2,M期低表達；γ亞型在G1期低表達，在S,G2,M期中度表達；ε亞型從G1到G

8、2期表達逐漸增高，到M期略有降低；ζ亞型G1期高表達，S期表達大幅下降，而從S期到M期表達量逐漸升高。2.Western blot檢測14-3-3ε在小鼠受精卵第一次有絲分裂四個時相蛋白的表達14-3-3ε蛋白在四個時相均有表達，G1到G2期表達逐漸增加，在G2期表達最高，在M期表達有所降低。3.間接免疫熒光實驗觀測14-3-3ε和Cdc25B在小鼠一細胞期受精卵四個時相的亞細胞共定位14-3-3ε（紅色熒光）和Cdc25B（綠色熒光）

9、在G1期和S期共定位于受精卵的細胞質(zhì)，在G2前期部分Cdc25B（綠色熒光）進入細胞核，G2后期在核內(nèi)可見綠色熒光的強度明顯加強，在M期14-3-3ε（紅色熒光）和Cdc25B（綠色熒光）均勻的分布于細胞質(zhì)。
　　結(jié)論：1、在小鼠一細胞期受精卵中主要表達亞型為ε和ζ兩個亞型。2、14-3-3ε蛋白在四個時相均有表達，G1到G2期表達逐漸增加，在G2期表達最高，在M期表達有所降低。3.14-3-3ε和Cdc25B在G1期和S期共定位