脂氧素A4干預(yù)TNF-α誘導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞ERK、JNK MAPK通路的研究.pdf

1、目的:觀察脂氧素A4(AT-Lipoxin A4)對腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosisfactorα，TNF-α)誘導(dǎo)的人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human pulmonarymicrovascular endothelia cells，HPMECs)炎癥相關(guān)通路ERK、JNKMAPK的影響并初步探討其可能的分子機(jī)制。
　　方法:通過慢病毒轉(zhuǎn)染基因沉默技術(shù)，使人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞TNF-R2(P75)不表達(dá)，僅表達(dá)TNF-R1

2、(P55)，使實驗結(jié)果均表現(xiàn)為TNF-R1(P55)通路的效應(yīng)-即炎癥反應(yīng)。實驗分為兩組即Ⅰ慢病毒轉(zhuǎn)染基因沉默P75組(n=3)和Ⅱ正常人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞組(n=3)，我們通過脂氧素A4(AT-Lipoxin A4)干預(yù)，其作用也主要集中在炎癥反應(yīng)。本實驗研究Ⅰ、Ⅱ兩組各再分為四亞組:(1)對照組、(2) TNF-α單獨(dú)刺激組、(3) LXA4(50ng/ml)預(yù)處理組和(4) LXA4(50ng/ml)單獨(dú)干預(yù)組。實時熒光定量PCR檢

3、測HPMECs白介素-8（Interleukin-8，IL-8）mRNA表達(dá)水平。細(xì)胞免疫熒光以及蛋白質(zhì)免疫印跡Western blot方法對HPMECsTNF-α受體下游關(guān)鍵信號分子如TRAF2、RIP、TRADD的定位定量檢測;蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot）方法檢測炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子VCAM-1(Vascular celladhesion molecule1)、E-Selectin(also known as End

4、othelial leukocyteadhesion molecule-1，and CD62E)的表達(dá)水平;蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot）方法檢測正常HPMECs以及TNF-α p75(-·-)HPMECs ERK MAPK、JNK MAPK磷酸化水平;蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)方法對TNF-α p75(-·-)HPMECs細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞漿蛋白中NF-κ B/p65水平的檢測以及NF-κ B/p65磷酸化水平

5、的檢測。
　　結(jié)果:(1) LXA4細(xì)胞毒性試驗在0-70ng/mL范圍內(nèi)進(jìn)行，結(jié)果表明lXA4在本實驗用量(50ng/mL)對細(xì)胞無毒性(2) LXA4在4小時點(diǎn)可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的IL-8表達(dá)的上調(diào)。(3) LXA4在6小時點(diǎn)可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的HPMECs炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子VCAM-1、E-Selectin表達(dá)的上調(diào);(4)Ⅰ慢病毒轉(zhuǎn)染基因沉默P75組和Ⅱ正常人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞組相比較， LXA4預(yù)處理1h可以抑

6、制TNF-α引起的HPMECs細(xì)胞核內(nèi)TRAF2、RIP、TRADD蛋白水平升高;(5)Ⅰ慢病毒轉(zhuǎn)染基因沉默P75組和Ⅱ正常人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞組相比較， LXA4預(yù)處理1h均可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的HPMECs ERK、JNK磷酸化水平的上調(diào)。(6)Ⅰ慢病毒轉(zhuǎn)染基因沉默P75組與Ⅱ正常人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞組相比較，LXA4預(yù)處理1h可以抑制TNF-α引起的HPMECs NF-κ B/p65的磷酸化及由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位。
　　結(jié)論