負載HBx抗原的DC疫苗在人免疫重建荷人肝癌裸鼠模型體內誘導的特異性抗肝癌效應的實驗研究.pdf

1、目的:
　　制備由HBx抗原負載的DC疫苗,檢測其在人免疫重建荷人肝癌裸鼠模型體內的抗腫瘤作用,為肝癌的生物免疫治療提供新的改良方式和科學依據(jù)。
　　方法:
　　1.穩(wěn)定轉染HBx蛋白HepG2人肝癌細胞系的鑒定及培養(yǎng):利用RT-PCR和Western blot法檢測穩(wěn)定轉染HBx蛋白的HepG2人肝癌細胞系中HBx蛋白的表達;確定穩(wěn)定轉染細胞株的G418篩選濃度。
　　2.人免疫重建裸鼠模型的建立及鑒定:將無免

2、疫滲漏的12只裸鼠隨機分為2組:腹腔注射人外周血單個核淋巴細胞6只作為人免疫重建組,腹腔注射無菌PBS6只作為空白對照組。觀察小鼠生物學特征;ELISA檢測小鼠外周血人IgG含量;HE染色法檢測小鼠肝脾組織中淋巴細胞的浸潤情況。
　　3.HBx抗原負載的DC疫苗在人免疫重建荷人肝癌模型體內的抗腫瘤作用觀察:在體外培養(yǎng)人外周血單個核細胞,利用細胞因子(GM-CSF、IL-4和TNF-α)誘導分化出DC細胞,將HBx抗原負載制備DC疫

3、苗,在15只人免疫重建24h后的裸鼠的右前腋下接種穩(wěn)定轉染HBx蛋白HepG2人肝癌細胞,建立人免疫重建荷人肝癌裸鼠模型;裸鼠皮下移植瘤種植后的第7天將其隨機分為3組進行治療:HBx-DC組,5只,每只腹腔注射HBx抗原致敏的DC疫苗2x105/0.2ml;DC組,5只,每只腹腔注射DC2x105/0.2ml;對照組,5只,每只腹腔注射生理鹽水0.2ml。觀察小鼠的一般情況及腫瘤組織的生長情況;ELISA法檢測小鼠血清中TH1、TH2類

4、細胞因子表達;PI染色法檢測腫瘤組織細胞周期改變,計算腫瘤細胞增殖指數(shù);病理學觀察腫瘤組織病理情況;免疫組織化學檢測相關因子P53、Bax、Casepas-3、Bcl-2、VEGF、CD34、MMP-2、CDK2、MMP-9、、P21表達情況。
　　結果:
　　1.RT-PCR檢測細胞系中HBx示:穩(wěn)定轉染HBx組,HBx mRNA的表達量明顯高于空白對照組及空載體組,且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western b

5、lot細胞系中HBx蛋白表達水平示:分別瞬時轉染不同劑量的HBx蛋白的HepG2細胞,其HBx蛋白表達水平均低于穩(wěn)定轉染HBx組,且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。觀察2周后發(fā)現(xiàn),600μg/ml即能使細胞漂浮死亡,即該細胞系篩選濃度。
　　2.12只人免疫重建裸鼠在9周內無死亡,未觀察到移植物抗宿主反應出現(xiàn)。分別于注射后的第2、4、6、8周,使用ELISA法檢測Balb/c裸鼠外周血中人IgG含量發(fā)現(xiàn),人免疫重建組小鼠外周血

6、人lgG含量隨著時間的推移逐漸升高,且各時間點間人lgG含量差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與對照組相比,人免疫重建組在相同時間點人lgG含量均明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HE染色檢測小鼠肝脾組織發(fā)現(xiàn):人免疫重建組裸鼠脾臟組織中淋巴細胞浸潤,人免疫重建組裸鼠肝臟組織以及對照組裸鼠肝、脾組織,均未見淋巴細胞浸潤。
　　3.HBx-DC組、DC組小鼠精神狀態(tài)較好,對照組小鼠精神萎靡,局部腫瘤組織出現(xiàn)潰破。HBx-

7、DC組小鼠的皮下移植瘤增長速度明顯減慢,差異在一周后具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。第六周將裸鼠處死取腫瘤組織稱重,發(fā)現(xiàn)HBx-DC組瘤重明顯低于其他兩組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),瘤種抑瘤率為0.6。治療的第5周,ELISA法檢測發(fā)現(xiàn):與其他兩組比較,HBx-DC組Th1類細胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α明顯上升,Th2類細胞因子IL-4、IL-6、IL-10明顯下降,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HBx-D

8、C組腫瘤細胞增殖指數(shù)顯著低于其他兩組(P<0.05)。病理學證實腫瘤為有HBx表達的人肝癌,且HBx-DC組腫瘤組織內腫瘤細胞出血、壞死,有大量的淋巴細胞浸潤。免疫組化發(fā)現(xiàn)HBx-DC組P53、Bax、Casepas-3、P21的表達顯著上調(P<0.05),Bcl-2、VEGF、CD34、MMP-2、MMP-9的表達顯著下調(P<0.05)。
　　結論:
　　1.HBx蛋白的穩(wěn)定表達對HepG2細胞的生物學行為產生了影響。