全細胞性腫瘤抗原以不同方式負載樹突狀細胞誘導肝癌特異性T細胞反應的實驗研究.pdf

1、肝癌是一種常見的惡性腫瘤，預后非常差，許多患者在初次診斷時已經(jīng)處于進展期或出現(xiàn)肝外轉(zhuǎn)移，只有很少一部分患者適合手術(shù)治療。隨著免疫學和腫瘤生物學的發(fā)展，免疫治療作為腫瘤治療的一種新策略?？鼓[瘤免疫的重要目的就是誘導針對腫瘤的特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和輔助性T(Th)淋巴細胞。而獲得腫瘤特異性CTL和Th細胞的一個重要方法就是負載各種腫瘤抗原的抗原呈遞細胞，如樹突狀細胞(dendriticcell，DC)。DC是體內(nèi)功能最強的職業(yè)

2、抗原提呈細胞，可攝取、加工、提呈抗原，在體內(nèi)、體外激發(fā)初次和繼發(fā)性T細胞免疫應答。近年來，DC越來越多地被用于抗腫瘤免疫。在DC免疫治療試驗研究中已成功地誘導出抗腫瘤反應，并且在一些臨床試驗中也表現(xiàn)出很好的效果。 目前已發(fā)現(xiàn)多種可被CD8+CTL識別的腫瘤抗原，但對于大多數(shù)腫瘤來說，仍無有效的腫瘤相關抗原或特異性抗原。另外，由于腫瘤突變，針對單一抗原的免疫治療有時并不能發(fā)揮其應有的作用。對于某些未知特異性抗原或相關性抗原的腫瘤，

3、為使DC能夠負載更多的抗原，利于臨床應用，人們研究了多種抗原的制備方法，例如：射線照射后的腫瘤細胞，腫瘤裂解物，腫瘤細胞來源的RNA，凋亡小體以及腫瘤來源的exosome等。這些方法，有可能通過MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ兩種途徑呈遞大量的抗原，誘導多價免疫反應，并且誘導的特異性CTL和Th細胞有可能通過協(xié)同作用而進一步放大免疫學效應。 選用全細胞性抗原作為肝癌DC免疫治療的抗原負載方式，是必需的且具有一定優(yōu)勢。理論上，這種抗原負載方

4、式，包括所有已知和未知的抗原，都有被DC呈遞到細胞表面的可能，因而能夠誘導出范圍更大，程度更強的免疫反應。這一點，對于肝癌這樣缺乏明確腫瘤抗原的惡性腫瘤來說，是尤為重要的。因此本研究選擇全細胞抗原作為DC抗原負載方式，包括腫瘤細胞裂解物致敏DC、腫瘤細胞和DC融合以及腫瘤細胞總RNA轉(zhuǎn)染DC等3種方式。我們對以3種形式負載抗原的DC瘤苗體外抗腫瘤活性進行了比較研究，并對它們體外誘導的T細胞反應的異同進行分析。 目的：本研究選擇不

5、同形式的全細胞腫瘤抗原負載DC，包括腫瘤細胞裂解物致敏DC，腫瘤細胞和DC融合，以及腫瘤細胞總RNA轉(zhuǎn)染DC等。對這3種抗原負載形式的DC瘤苗體外抗腫瘤活性進行比較，分析其體外誘導T細胞反應的異同，以期選擇更好的適宜臨床應用的DC瘤苗。 方法： 1.肝癌患者DC的誘導及鑒定：選擇肝癌患者及正常人外周血，血細胞分離機分離富集外周血PBMC，經(jīng)淋巴細胞分離液梯度離心、聚苯乙烯細胞培養(yǎng)板貼壁純化后，加入含GM-CSF和IL-4

6、的X-vivo15培養(yǎng)液聯(lián)合誘導DC分化，誘導d6加入TNF-α促進DC成熟。分別以倒置顯微鏡、電子顯微鏡觀察DC形態(tài)變化；FCM檢測細胞表型變化；MTT法檢測DC刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力。 2.腫瘤細胞總RNA轉(zhuǎn)染DC誘導腫瘤特異性細胞毒效應：綠色熒光蛋白質(zhì)粒載體pEGFP-C3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細胞HepG2，Trizol法提取篩選后細胞HepG2-GFP總RNA；分離肝癌患者外周血單核細胞體外誘導DC，總RNA轉(zhuǎn)染DC，熒

7、光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染前后DC表型變化；ELISA法檢測轉(zhuǎn)染前后上清中IL-12變化情況；取患者外周靜脈血單個核細胞(PBMC)中非貼壁細胞(淋巴細胞，L)，調(diào)整細胞密度為1×106/mL，以含IL-2、10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)；將RNA-DC以5×104/mL密度加入上述淋巴細胞中，共同孵育72h(設未致敏DC組和單獨淋巴細胞組為對照)，72h后再次加入同劑量DC，孵育72h，收獲細胞分別稱為RNA-DC

8、-L、DC-L和L。以RNA-DC-L、DC-L和L作為效應細胞，肝癌細胞株HepG2、SMMC7721及白血病細胞株K562為靶細胞，以不同效靶比(5：1、10：1、20：1)接種于96孔板，48h后MTT法測定效應細胞對各腫瘤細胞的殺傷作用。 3.三種全細胞性瘤苗體外細胞毒活性比較：分別以肝癌細胞株HepG2凍融抗原致敏患者DC(Lys-DC)，HepG2總RNA轉(zhuǎn)染DC(RNA-DC)，HepG2與DC融合(Fus-DC)

9、作為刺激細胞，取患者外周靜脈血單個核細胞(PBMC)中非貼壁細胞(淋巴細胞，L)，調(diào)整細胞密度為1×106/mL，以含IL-2、10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)；將Lys-DC、RNA-DC、Fus-DC以5×104/mL密度分別加入上述淋巴細胞中，共同孵育72h(設未致敏DC組和單獨淋巴細胞組為對照)，再次加入同劑量DC，孵育72h，收獲細胞分別稱為Lys-DC-L、RNA-DC-L、Fus-DC-L、DC-L和L。以Lys-DC-

10、L、RNA-DC-L、Fus-DC-L、DC-L和L作為效應細胞，肝癌細胞株HepG2為靶細胞，以效靶比20：1接種于96孔板，48h后MTT法測定效應細胞對各腫瘤細胞的殺傷作用。 4.三種瘤苗誘導腫瘤特異性CD8+T細胞功能比較：分離CD8+T細胞，以含IL-2(400U/mL)、10％FCS的RPMI1640重懸，調(diào)整細胞密度為1×106/mL，接種于24孔細胞培養(yǎng)板；將Lys-DC、RNA-DC、Fus-DC以5×104/

11、mL密度分別加入上述淋巴細胞中，共同孵育72h(設未致敏DC組和單獨淋巴細胞組為對照)，72h后再次加入同劑量DC，孵育72h，收獲細胞分別稱為Lys-DC-T、RNA-DC-T、Fus-DC-T、DC-T和T。收集各組細胞上清，應用IFN-γELISA檢測試劑盒檢測IFN-γ分泌。 5.三種瘤苗誘導腫瘤特異性CD4+T細胞功能比較：分離CD4+T細胞，以含IL-2(400U/mL)、10％FCS的RPMI1640重懸，調(diào)整細胞

12、密度為2×105/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板；將Lys-DC、RNA-DC、Fus-DC以2×104/mL密度分別加入上述淋巴細胞中，共同孵育72h(設未致敏DC組和單獨淋巴細胞組為對照)，72h后再次加入同劑量DC，孵育96h后，MTT法檢測各種瘤苗刺激自體CD4+T細胞增殖的能力。 結(jié)果： 1.肝癌患者DC鑒定：誘導后，患者DC顯示出典型的形態(tài)及表型特征。其中，誘導d8(加TNF-α活化48h)，各抗原表達量明顯升

13、高，分別為：CD83(95.94±1.78)％、CD86(96.33±2.19)％、CD80(94.19±1.89)％、HLA-DR(93.71±3.67)％，為典型DC表型；健康對照DC各抗原表達量為CD83(94.78±3.67)％、CD86(94.65±2.50)％、CD80(94.70±1.69)％、HLA-DR(93.06±3.72)％，二者間無顯著性差異(P＞0.05)?；旌狭馨图毎磻Y(jié)果顯示，患者DC具有高效地刺激同種異

14、體淋巴細胞增殖的能力，其刺激指數(shù)(SI)與健康對照DC的SI無顯著差異(P＞0.05)。 2.腫瘤細胞總RNA轉(zhuǎn)染DC誘導腫瘤特異性細胞毒效應：pEGFP-C3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細胞HepG2后可得到穩(wěn)定表達GFP的細胞HepG2-GFP，熒光顯微鏡下所有細胞均呈現(xiàn)綠色熒光，流式細胞儀檢測綠色熒光蛋白表達99％以上；HepG2-GFP總RNA轉(zhuǎn)染的DC熒光顯微鏡下呈綠色熒光，流式細胞儀檢測GFP表達陽性細胞比率可達50％以上，轉(zhuǎn)染后D

15、C表面分子CD80(13.2％上升至86.7％)，HLA-DR(38.9％上升至97.9％)，CD83(0.9％上升至97.1％)，CD86(31.2％上升至92.5％)表達明顯升高，上清IL-12分泌量顯著增高(61.3±8.1ng/L→287.4±29.3ng/L，P＜0.05)；RNA-DC-L對HepG2的殺傷率明顯高于對另一肝癌細胞SMMC7721和白血病細胞K562的殺傷率，對SMMC7721的殺傷率也高于對白血病細胞K56

16、2的殺傷率。 3.三種全細胞性瘤苗體外細胞毒活性比較：Lys-DC-L、Fus-DC-L、RNA-DC-L組均顯示對HepG2高效特異的殺傷活性，顯著高于DC-L組和單純L組；但Fus-DC-L、RNA-DC-L對HepG2的殺傷率明顯高于Lys-DC-L組；而Fus-DC-L、RNA-DC-L組對HepG2的殺傷率無明顯區(qū)別。 4.三種瘤苗誘導腫瘤特異性CD8+T細胞功能比較：Lys-DC、Fus-DC、RNA-DC刺

17、激的CD8+T細胞組IFN-γ分泌顯著高于DC刺激的CD8+T細胞組和單純CD8+T細胞組；但Fus-DC、RNA-DC刺激組IFN-γ分泌顯著高于Lys-DC刺激組；而Fus-DC、RNA-DC刺激組IFN-γ分泌無明顯區(qū)別。 5.三種瘤苗誘導腫瘤特異性CD4+T細胞功能比較：Lys-DC、Fus-DC、RNA-DC組刺激自體CD4+T細胞增殖功能顯著高于DC組；但Lys-DC、Fus-DC、RNA-DC刺激自體CD4+T細胞

18、增殖功能無明顯區(qū)別。 結(jié)論： 1.從肝癌患者外周血單個核細胞，可成功誘導出功能正常的樹突狀細胞，肝癌患者體外誘導培養(yǎng)的DC，可以應用于肝癌的免疫治療。 2.腫瘤總RNA轉(zhuǎn)染的DC以及融合瘤苗能更有效的誘導腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞反應，是更為有效的DC免疫治療方式。腫瘤總RNA轉(zhuǎn)染操作簡單，應用裸RNA轉(zhuǎn)染方法對細胞無損傷，并且在某些腫瘤細胞過少或腫瘤組織過小患者中，可以通過PCR方法擴增得到大量RNA，因此更