MOO對分子搭橋中細(xì)胞周期及TRPC6的影響.pdf

1、研究背景和目的：
　　 近年來，缺血性心臟病發(fā)病率逐年上升，全世界發(fā)病率為2％。心肌梗死(myocardial infarction，MI)是目前嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，而慢性心功能衰竭(chronic heart failure，CHF)是MI致死的主要因為之一。分子搭橋術(shù)(molecular bypass，又名治療性血管新生therapeutic angiogensis)為病損心臟的細(xì)胞及血管重建和衰竭細(xì)胞的功能恢復(fù)提供

2、了一種全新的治療策略。設(shè)想通過分子搭橋術(shù)治療缺血性心臟病，即通過一些方法的刺激包括某些藥物的治療作用增加功能性的冠狀動脈分支或側(cè)支，達(dá)到恢復(fù)缺血心肌血供，改善患者癥狀和預(yù)后的目的。近十年的研究結(jié)果證實，分子搭橋能幫助機(jī)體建立有效的側(cè)支循環(huán)，從根本上緩解心肌缺血癥狀，改善病情，從而分子搭橋已經(jīng)成為目前世界心血管醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點課題。因此，深入研究分子搭橋的內(nèi)在機(jī)制以及開發(fā)有效的促進(jìn)分子搭橋藥物，必將極大的提高缺血性心臟患者的生活質(zhì)量和延長壽

3、命。本導(dǎo)師組近年來一直致力于巴戟天糖鏈(Morinda officinalisoligosaccharides，MOO)保護(hù)心臟作用的研究，前期的研究初步證實：MOO具有明顯促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖和分化的作用，提高分子搭橋過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)等各種生長因子的表達(dá)，而對其下游瞬時受體電位蛋白C(TRPC)及其信號傳導(dǎo)的影響尚屬空白。因此，本課題在前期工作的基礎(chǔ)上采用基因芯片及Western-b

4、lot技術(shù)，從基因及蛋白表達(dá)層面觀察MOO在促分子搭橋過程中對TRPC6通道蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，采用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測實驗各組細(xì)胞增殖情況，并探討MOO的藥理作用機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 1 ECV304細(xì)胞的培養(yǎng)
　　 ECV304細(xì)胞50ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，加入含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃，5％CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2d，細(xì)胞逐漸長成單層融合狀。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞核圓，

5、核膜清晰，細(xì)胞呈梭形多邊狀，表現(xiàn)為典型鋪路石樣。當(dāng)培養(yǎng)瓶長滿80％左右即可用胰蛋白酶消化傳代或凍存。
　　 2細(xì)胞模型的制作與確定
　　 選取復(fù)蘇后第3～8代生長狀念良好的細(xì)胞。建立四組模型：①缺氧1h復(fù)氧1h；②缺氧1h復(fù)氧2h；③缺氧2h復(fù)氧1h；④缺氧2h復(fù)氧2h。通過形念學(xué)觀察和統(tǒng)計學(xué)分析最終確定模型制作的條件為缺氧1h，復(fù)氧2h。
　　 3實驗分組
　　 本實驗分為六組：
　　 ①正常細(xì)

6、胞組
　　 ②缺氧復(fù)氧損傷模型組
　　 ③缺氧復(fù)氧損傷模型+陽性對照藥麝香保心丸組(2g/L)
　　 ④缺氧復(fù)氧損傷模型+小劑量MOO組(50mg/L)
　　 ⑤缺氧復(fù)氧損傷模型+中劑量MOO組(150mg/L)
　　 ⑥缺氧復(fù)氧損傷模型+大劑量MOO組(450mg/L)
　　 4觀察指標(biāo)
　　 正常培養(yǎng)ECV304細(xì)胞3～8代，制作缺氧復(fù)氧損傷模型，給予不同劑量MOO干預(yù)24h～

7、48h，用倒置顯微鏡觀察其生長狀態(tài)后，①FCM檢測各劑量組細(xì)胞增殖情況；②基因芯片檢測各組血管生成基因mRNA表達(dá)情況；③提取蛋白用蛋白印記法測量各藥物組TRPC6表達(dá)情況。
　　 5統(tǒng)計學(xué)處理
　　 結(jié)果：用SPSS17.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。檢驗結(jié)果均取α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。組間比較采用單因素方差分析，當(dāng)差異有顯著意義時進(jìn)一步用q檢驗進(jìn)行兩兩比較。
　　 結(jié)果：

8、
　　 1損傷24h后，鏡下可見模型組細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，間隙明顯變大，并有部分脫落。陽性藥物組及MOO各劑量組均可促進(jìn)細(xì)胞增殖，其作用隨劑量增加而增強(qiáng)。
　　 2 FCM檢測結(jié)果顯示MOO可提高G2期+S期細(xì)胞比例，促進(jìn)細(xì)胞增殖，并呈劑量依賴性。
　　 3基因芯片結(jié)果顯示：MOO可顯著上調(diào)多種促血管生成基因mRNA的表達(dá)及TRPC6信號通路中多種相關(guān)基因mRNA的表達(dá)，下調(diào)多種抑制血管生成基因mRNA

9、的表達(dá)。
　　 4 Western-blot顯示MOO可提高細(xì)胞內(nèi)TRPC6蛋白的表達(dá)，并呈劑量依賴性。
　　 結(jié)論：
　　 1 MOO可保護(hù)ECV304細(xì)胞的缺氧復(fù)氧損傷，提高缺氧復(fù)氧損傷后內(nèi)皮細(xì)胞G2+S期細(xì)胞比例，促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　 2 MOO可顯著上調(diào)TRPC6信號通路中多種促血管生成基因mRNA的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，血管新生。
　　 3 MOO促進(jìn)分子搭橋的作用機(jī)制與其促進(jìn)TRPC