CXCR4啟動的條件復制型腺病毒聯(lián)合DAL-1轉染人羊水干細胞對肺癌的治療作用.pdf

1、療提供一種新的策略。 方法 方法 一、條件復制型腺病毒載體 Ad-CXCR4-DAL-1 和 Ad-CXCR4-GFP 的構建：構建重組質粒 pAdxsi-CXCR4-DAL-1 和 pAdxsi-CXCR4-GFP， 利用 293 細胞包裝成條件復制型腺病毒 Ad-CXCR4-DAL-1 和 Ad-CXCR4-GFP；TCID50 法測定Ad-CXCR4-DAL-1 和 Ad-CXCR4-GFP 滴度。 二 、 CXCR4 在 A54

2、9 細 胞 內 啟 動 活 性的 檢 測 、 條 件 復 制型 腺 病 毒Ad-CXCR4-DAL-1 轉染 A549 細胞后復制數(shù)和 DAL-1 表達的檢測： 熒光定量 PCR檢測 5 種肺癌細胞株 CXCR4mRNA 表達，篩選出表達最高的 A549 細胞；將構建的 Ad-CXCR4-DAL-1（實驗組） 、Ad-CXCR4-GFP（對照組）和 Ad-NULL（空載體組） 分別轉染至 A549 細胞中， 熒光定量 PCR 檢測各組

3、E1AmRNA、 E4 DNA和 DAL-1 mRNA 表達；Western Blot 檢測各組 DAL-1 蛋白的表達。 三、條件復制型腺病毒 Ad-CXCR4-DAL-1 功能的檢測：實驗分四組：實驗組、對照組、空載體組和空白對照組。流式細胞儀檢測各組分別轉染 A549 細胞和 16HBE 細胞后的凋亡率；CCK-8 實驗檢測各組分別轉染 A549 細胞和 16HBE細胞后的細胞毒性，計算各組細胞活性率。 四、條件復制型腺病毒 Ad

4、-CXCR4-DAL-1 體內抑瘤作用的檢測：實驗分三組：實驗組、空載體組和 PBS 組。2*106 個 A549 細胞重懸于 200μLPBS，注射至裸鼠皮下，建立裸鼠 A549 細胞移植瘤模型。瘤內注射各組病毒，每隔 1 天注射 1 次，每次每只 1*109PFU，共 4 次。觀察各組腫瘤生長速度和腫瘤體積；末次注射后的第 21 天處死全部裸鼠，分別稱取各組裸鼠腫瘤重量，各組均取出腫瘤、 肝臟和肺臟， 熒光定量 PCR 檢測各組腫瘤

5、、 肝臟和肺臟中 E4 DNA 和 DAL-1 mRNA 表達。 五、人羊水干細胞的分離與鑒定：采用貼壁法分離培養(yǎng)人羊水干細胞；對第2 代人羊水干細胞進行核型分析；流式細胞儀檢測第 2 代人羊水干細胞表面抗原分子的表達；CCK-8 實驗檢測第 2 代人羊水干細胞的增殖情況，連續(xù)檢測 5 天，根據(jù)吸光度（OD）值描繪生長曲線。 無明顯差異（P>0.05） ，第5天活性率明顯降低（P0.05） ；與對照組相比，實驗組前3天細胞凋亡率和

6、細胞活性率無明顯差異（P>0.05） ，第4天凋亡率增加（P0.05）；熒光定量 PCR 顯示，實驗組 E4 DNA 和 DAL-1 mRNA 表達較空載體組與 PBS 組明顯增加（P0.05） ；熒光定量 PCR 顯示，實驗組 E4 DNA 和 DAL-1 mRNA 表達較空載體組、hAFS 組和 PBS 組明顯上升（P<0.01） 。各組肝臟和肺臟均無 E4 DNA 和DAL-1 mRNA 表達。 實驗證明條件復制型腺病