人CXCR4基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞提高急性心肌梗死移植后歸巢性的實驗研究.pdf

1、第一部分:攜帶hCXCR4基因慢病毒載體的構(gòu)建及豬骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
　　目的:利用含有人CXCR4基因的質(zhì)粒，構(gòu)建慢病毒載體，將構(gòu)建好的慢病毒載體轉(zhuǎn)染分離、培養(yǎng)的豬MSCs，觀察MSCS hCXCR4的表達。方法貼壁離心法分離并培養(yǎng)小型豬骨髓源性MSCs，將含人CXCR4基因的質(zhì)粒進行PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、挑克隆進行質(zhì)粒提取鑒定，進行病毒包裝、濃縮后，轉(zhuǎn)染MSCs構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。
　　結(jié)果:從小型豬骨髓體

2、外成功分離、純化并擴增MSCs，慢病毒Lenti6.3-hCXCR4-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染MSCs，并穩(wěn)定高表達人CXCR4。結(jié)論成功構(gòu)建了Lenti6.3-hCXCR4-IRES2-EGFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的豬MSCs細胞系，為進一步實驗研究奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分: hCXCR4基因修飾的豬MSCs體外趨化實驗研究
　　目的:將hCXCR4基因修飾的豬MSCs，在體外利用Transwell體外遷移體系探討SDF-1-CXCR4

3、對MSCs遷移、趨化能力的影響。
　　方法:慢病毒顆粒Lenti6.3-hCXCR4-IRES2-EGFP及l(fā)enti-nega-EGFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MSCs，通過Transwell體外遷移系統(tǒng)，采用0、100、200、300ng/ml四個SDF-1濃度組在體外進行實驗，觀察其對基因轉(zhuǎn)染的MSCs的趨化效應(yīng);并利用5-aza誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的MSCs，觀察其分化能力。結(jié)果體外5-aza誘導(dǎo)后，部分基因修飾的MSCs成梭形，結(jié)蛋白、肌球蛋白

4、重鏈、心肌特異性肌鈣蛋白Ⅰ免疫細胞化學(xué)染色均為陽性。MSCs-hCXCR4有隨SDF-1濃度增加而趨化增加的趨勢，但其增加的趨勢至300ng/ml時明顯減弱。CXCR4拮抗劑AMD3100可明顯抑制但不能完全阻斷SDF-1-CXCR4相互作用引起的趨化效應(yīng)。結(jié)論轉(zhuǎn)染hCXCR4基因并未改變MSCs的細胞增殖活動周期，體外誘導(dǎo)可分化成心肌樣細胞。高表達hCXCR4的MSC體外對SDF-1α趨化活性顯著增加。
　　第三部分: hCXC

5、R4基因修飾的MSCs移植治療豬急性心肌梗死的研究
　　目的:探討人CXCR4基因修飾后的同種異體MSCs移植治療豬急性心肌梗死的作用。方法從小型豬骨髓體外成功分離、純化并擴增MSCs，慢病毒Lenti6.3-hCXCR4-IRES-EGFP及l(fā)enti-nega-EGFP轉(zhuǎn)染MSCs。前降支封堵法建立雌性小型豬急性心肌梗死模型，分為生理鹽水組、MSCs+NEGA組、MSCs+hCXCR4組，進行雄性源性MSCs移植。細胞移植后1

6、周、1月、3月行磁共振檢測并于1周、1月、3月時分別處死部分動物，取心臟標本行相關(guān)檢查。結(jié)果成功建立雌性小型豬急性心肌梗死模型。組織學(xué)分析顯示MSCs+hCXCR4組細胞移植后1周、1月時較對照組顯著高表達hCXCR4，并可檢測到Y(jié)染色體特異性SPY基因;至3月時均未檢測到;MSCs+hCXCR4組細胞移植后1周、1月、3月時較對照組顯著高表達VEGF，同時毛細血管及小動脈密度明顯增加;同時MRI檢查顯示1月、3月時其心功能較對照有不同

7、程度的改善。結(jié)論人CXCR4基因轉(zhuǎn)染MSCs后移植更加增強其治療心肌梗死的作用，其機制可能系通過增強其旁分泌作用實現(xiàn)。
　　第四部分:急性心肌梗死誘導(dǎo)心肌細胞進入分裂周期的初步探討
　　目的:探討急性心肌梗死后是否有心肌細胞重新進入細胞周期并進行細胞分裂。方法前降支結(jié)扎法制作制作SD大鼠急性心肌梗死模型，分別于梗死后3天、1周、2周、3周、4周各處死5只，及5只假手術(shù)大鼠，取出心臟組織，做Masson染色，使用免疫組化法測c