Tim-3在腫瘤相關(guān)巨噬細胞極化及肝細胞肝癌進展中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　原發(fā)性肝細胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，每年有超過500萬人死于HCC[1，2]。盡管肝細胞肝癌的診斷和治療都有許多新進展，但是其復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率卻居高不下。因此，深入研究HCC的發(fā)生機制、尋求HCC的治療新靶點仍然是我們面臨的重要課題。
　　越來越多的研究表明腫瘤微環(huán)境在肝細胞肝癌的生長侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tu

2、morassociatedmacrophages，TAMs）是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分，它可以促進HCC的生長和轉(zhuǎn)移。眾所周知，巨噬細胞的功能多樣、可塑性強，不同的局部組織環(huán)境刺激巨噬細胞產(chǎn)生不同功能。巨噬細胞主要有兩種類型:經(jīng)典活化型巨噬細胞(M1)和替代活化型巨噬細胞(M2)。M1主要由LPS或IFN-γ誘導，可以分泌IL-12、TNF-α、iNOS等促炎因子，在Th1型免疫應答及抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用;而M2可以由IL-4、I

3、L-13、TGF-β等誘導形成，高表達IL-10、CD206、IL-6及Arg-1等分子，表現(xiàn)為抗炎活性，有很強的組織修復能力及促腫瘤活性。新近研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞可以馴化募集到腫瘤組織中的單核細胞，分化為腫瘤相關(guān)巨噬細胞，并分泌IL-10、TGF-β等細胞因子而表現(xiàn)為M2表型。基因表達譜研究證實肝癌組織浸潤巨噬細胞中多種M2型相關(guān)基因表達明顯上調(diào)。臨床研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的TAMs數(shù)量與病人預后顯著相關(guān)，TAMs的數(shù)量越多，病人的預后越差。

4、因此，闡明TAMs活化機制，揭示促進TAMs替代性活化的關(guān)鍵免疫分子具有重要意義。
　　Tim-3(T-cellimmunoglobulinandmucin-domain-containingmolecule-3)最初被認為是Th1型細胞的特異性標記。隨后的研究發(fā)現(xiàn)Tim-3廣泛表達于多種免疫細胞，如NK、DC、巨噬細胞等，甚至表達在一些腫瘤細胞上，如宮頸癌、卵巢癌。眾多研究證實，Tim-3不僅抑制T細胞介導的免疫反應促進免疫耐受

5、，而且參與腫瘤及慢性病毒性感染中T細胞耗竭的形成。Tim-3與其配體相互作用，在不同固有免疫細胞中發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)作用。2007年Science報道，Tim-3高表達于巨噬細胞，并通過NF-κB通路促進巨噬細胞的炎癥反應。但Tim-3是否參與巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)，進而影響TAMs的功能并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，迄今尚未見報道。本實驗室前期發(fā)現(xiàn)HCC患者外周血中單核細胞及腫瘤浸潤TAMs中Tim-3表達顯著升高，提示Tim-3參與TAMs活化

6、及HCC發(fā)生發(fā)展。本研究擬以HCC為研究對象，探討腫瘤微環(huán)境促進TAMs表達Tim-3，進而調(diào)節(jié)TAMs功能促進HCC發(fā)展的作用及分子機制。
　　方法與結(jié)果
　　1.肝癌患者TAMs中Tim-3表達顯著升高，且與預后負相關(guān)
　　免疫組化及免疫熒光檢測肝癌組織芯片中69對肝癌組織及其對應癌旁組織中CD68及Tim-3的表達，結(jié)果均顯示CD68與Tim-3顯著共表達，與癌旁組織相比，癌組織中巨噬細胞上Tim-3的表達顯著升

7、高(p=0.0220)，生存曲線分析發(fā)現(xiàn)CD68+TAMs中Tim-3表達高的肝癌患者生存期較短，預后較差(p＜0.001)。
　　2.腫瘤微環(huán)境中的TGF-β促進巨噬細胞表達Tim-3及M2-樣極化
　　文獻顯示，腫瘤細胞及其微環(huán)境可以馴化TAMs。為研究腫瘤微環(huán)境對TAMs中Tim-3表達的調(diào)節(jié)作用，取對數(shù)生長期的鼠肝癌細胞系H22，無血清培養(yǎng)24h后收集上清成為條件性培養(yǎng)基(hepatocellularcarcinom

8、aConditionedMedium，HCM)。條件性培養(yǎng)基刺激新鮮分離的小鼠腹腔巨噬細胞，流式或RT-PCR檢測巨噬細胞上Tim-3及巨噬細胞極化相關(guān)分子標記的表達。結(jié)果顯示，HCM顯著促進巨噬細胞上Tim-3表達，且呈劑量依賴性和時間依賴性;伴隨Tim-3的表達升高，HCM促進巨噬細胞M2相關(guān)分子CD206、Arg-1的表達，抑制巨噬細胞中M1相關(guān)分子TNF-α表達。提示腫瘤微環(huán)境促進巨噬細胞Tim-3表達及巨噬細胞向M2-樣極化。

9、
　　肝癌患者外周血及肝癌局部有較高水平的TGF-β。為研究TGF-β對巨噬細胞Tim-3表達及其極化的影響，進行TGF-β阻斷實驗:腹腔巨噬細胞與TGF-β受體阻斷劑SB431542孵育24h（DMSO做對照）后，加入條件性培養(yǎng)基，繼續(xù)陪養(yǎng)24h。流式、RT-PCR檢測相關(guān)分子表達。結(jié)果顯示，SB431542抑制TGF-β的受體后明顯抑制HCM介導的巨噬細胞Tim-3表達升高及巨噬細胞M2極化（表現(xiàn)為CD206、IL-10、Ar

10、g-1降低）。收集另一種鼠肝癌細胞系Hepa1-6的條件培養(yǎng)基重復上述實驗得到了相同結(jié)果。與此相對應，10ng/ml的外源性TGF-β可以顯著促進巨噬細胞中Tim-3表達。上述結(jié)果提示，腫瘤微環(huán)境中的TGF-β促進巨噬細胞上Tim-3的表達及巨噬細胞M2極化。H22荷瘤鼠的體內(nèi)實驗結(jié)果支持這一假設(shè):與脾臟CD11b+細胞相比，荷瘤鼠腫瘤組織浸潤CD11b+中Tim-3表達顯著升高。
　　為了進一步驗證上述結(jié)果，我們收集了健康人和肝

11、細胞肝癌病人的血清，刺激人單核細胞系THP-1。24h后流式檢測Tim-3及CD206表達，結(jié)果表明與健康對照相比，肝細胞肝癌病人的血清可以顯著上調(diào)THP-1上Tim-3的表達及其M2-樣極化（CD206升高）;而SB431542預處理THP-1，阻斷TGF-β后，明顯抑制肝癌病人血清介導的THP-1上Tim-3表達升高及巨噬細胞M2極化，提示腫瘤微環(huán)境中的TGF-β促進巨噬細胞Tim-3表達及其M2極化。
　　為進一步研究TGF

12、-β調(diào)節(jié)Tim-3表達的機制。構(gòu)建了Tim-3啟動子的報告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染鼠的巨噬細胞RAW264.7及人肝癌細胞Huh-7后，分別加入不同濃度TGF-β（0ng、2.5ng、5ng、10ng/mL）刺激，8h后雙熒光素酶報告基因分析檢測Tim-3的啟動子活性。結(jié)果顯示，TGF-β劑量依賴性促進RAW264.7及Huh-7中的Tim-3啟動子活性。提示，TGF-β在轉(zhuǎn)錄水平上促進Tim-3的表達。3.腫瘤微環(huán)境及TGF-β通過Tim-3促進巨

13、噬細胞極化
　　為了研究Tim-3在腫瘤微環(huán)境及TGF-β誘導的巨噬細胞極化中的作用，我們在HCM或TGF-β刺激巨噬細胞前分別用三種方法阻斷Tim-3通路。阻斷方法如下:Tim-3的阻斷性抗體與巨噬細胞共孵育1h（IgG為對照）;合成針對Tim-3的siRNA，Lipo2000轉(zhuǎn)染腹腔巨噬細胞24h（無關(guān)序列NC為對照）;表達Tim-3shRNA(shTim-3-Lv)的慢病毒以MOI20感染骨髓誘導的巨噬細胞（空病毒為對照），

14、72后慢病毒干擾效果顯現(xiàn)。上述處理的巨噬細胞分別以10ng/mL的TGF-β或適量的條件性培養(yǎng)基刺激24h，ELISA檢測IL-10及IL-12表達。結(jié)果顯示，阻斷巨噬細胞上的Tim-3后，HCM或TGF-β刺激的巨噬細胞中IL-12分泌顯著升高而IL-10分泌降低。進一步westernblot檢測阻斷Tim-3后巨噬細胞中極化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，結(jié)果顯示阻斷Tim-3后巨噬細胞中M1極化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子STAT-1磷酸化水平升高了而M2相

15、關(guān)轉(zhuǎn)錄因子STAT-6磷酸化水平降低。上述結(jié)果提示，Tim-3參與腫瘤微環(huán)境及TGF-β誘導的巨噬細胞極化過程。
　　4.巨噬細胞表達的Tim-3顯著促進肝細胞肝癌進展
　　眾多文獻證實，M2極化的巨噬細胞促進肝癌細胞生長及轉(zhuǎn)移。為了研究Tim-3在其中的作用，我們設(shè)計下列體內(nèi)外實驗。
　　4.1干擾巨噬細胞Tim-3表達顯著抑制肝癌細胞系的生長及遷移
　　慢病毒感染骨髓誘導的巨噬細胞以干擾Tim-3的表達，72

16、h后加入10ng/ml的IL-4繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集巨噬細胞培養(yǎng)上清與全培養(yǎng)基以1∶1的比例混合，刺激小鼠肝癌細胞系Hepa1-6，進行生長曲線、集落形成及Transwell實驗。結(jié)果顯示，與對照相比，慢病毒干擾Tim-3后巨噬細胞培養(yǎng)上清刺激Hepa1-6細胞的生長及克隆形成能力顯著降低(p=0.032);與此相對應，Transwell實驗表明干擾巨噬細胞Tim-3表達明顯抑制Hepa1-6的遷移和侵襲能力(p＜0.001)。

17、　　4.2干擾巨噬細胞Tim-3表達顯著抑制荷瘤鼠體內(nèi)H22移植瘤生長
　　肝癌細胞系H22與慢病毒感染Tim-3的巨噬細胞按4∶1的比例混合后在BALB/c小鼠腹股溝皮下成瘤，對照慢病毒感染巨噬細胞為對照。裸眼可見后隔天測量瘤體體積，12天后處死稱瘤重，并做切片，免疫組化染色增殖指標Ki67。生長曲線及瘤重結(jié)果均表明，干擾巨噬細胞Tim-3表達明顯抑制移植瘤的生長。免疫組化染色結(jié)果顯示，干擾巨噬細胞Tim-3組腫瘤中Ki67顯著

18、降低，提示肝癌細胞增殖受到抑制。
　　5Tim-3通過NF-κB調(diào)控巨噬細胞IL-6表達，促進HCC細胞系生長
　　眾所周知，巨噬細胞通過分泌活性細胞因子發(fā)揮其功能。鑒于此我們用CBA檢測上述生長曲線及克隆形成實驗中巨噬細胞上清中的細胞因子，結(jié)果顯示，干擾Tim-3表達顯著抑制了巨噬細胞IL-10、IL-6、GM-CSF的分泌，促進IL-12產(chǎn)生，而IL-1β沒有明顯變化。
　　IL-6在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，

19、其表達受NF-κB的調(diào)控。文獻報道，Tim-3活化EAE小鼠巨噬細胞中的NF-κB通路。因此，我們設(shè)計實驗研究NF-κB-IL-6在Tim-3介導的巨噬細胞促腫瘤生長中的作用。shTim-3-Lv感染巨噬細胞后，再用IL-4或者TGF-β刺激，收蛋白westernblot檢測NF-κB下游分子p65的活化情況。結(jié)果表明干擾巨噬細胞上的Tim-3后無論是加入IL-4還是TGF-β，p65的磷酸化形式都是下降的，與IL-6的變化相一致。進一

20、步干擾掉巨噬細胞上Tim-3的同時抑制NF-κB，加入IL-4或者TGF-β刺激，24h后檢測上清中IL-6的水平，ELISA結(jié)果表明NF-κB的抑制性配體可以逆轉(zhuǎn)shTim-3-Lv對IL-6的抑制作用。為進一步驗證IL-6對肝細胞肝癌的生長作用，我們利用IL-6的阻斷性抗體預處理shTim-3-Lv感染巨噬細胞的上清后刺激Hepa1-6細胞，72h后檢測其生長狀況。結(jié)果表明阻斷IL-6后，shTim-3-Lv介導的巨噬細胞對Hepa

21、1-6細胞生長的促進作用消失。我們的上述結(jié)果提示，Tim-3通過NF-κB調(diào)控IL-6的表達，促進HCC細胞的生長。
　　結(jié)論:
　　肝細胞肝癌患者TAMs中Tim-3表達明顯升高，且TAM中Tim-3表達與HCC患者預后顯著相關(guān);HCC患者腫瘤微環(huán)境中的TGF-β在轉(zhuǎn)錄水平促進巨噬細胞表達Tim-3，并且促進其M2極化;TAMs中表達升高的Tim-3通過NF-κB促進巨噬細胞IL-6的表達，進而在體內(nèi)外促進肝細胞肝癌的生長