腫瘤相關(guān)基因TIPE及CUL4A在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及生物學(xué)作用研究.pdf

1、第一部分，TIPE在肝細(xì)胞肝癌發(fā)生中的生物學(xué)作用及其分子機(jī)制研究
　　 研究背景：
　　 半個世紀(jì)以來，惡性腫瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重影響并制約全球人類健康的主要因素，其發(fā)病率及致死率也逐年增高。在我國，消化系統(tǒng)腫瘤一直是醫(yī)護(hù)和科研工作者關(guān)注及研究的重點(diǎn)，而近幾年來肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病率已經(jīng)躍居腫瘤發(fā)病的第五位，其致死率卻已躍居第二位。然而由于肝細(xì)胞肝癌早期癥狀不明顯且發(fā)病相對緩慢，病人一經(jīng)確診往往已經(jīng)錯過了手術(shù)及化療的最佳時期。因此

2、，研究肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病機(jī)制，并尋找治療肝細(xì)胞肝癌的新型分子靶向藥物已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　 腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8〔Tumornecrosisfactor(TNF)-alpha-inducedprotein8，TNFAIP8〕，簡稱TIPE，亦稱為SCC-S2、GG2-1、MDC-3.13，目前發(fā)現(xiàn)其與TIPE1、TIPE2和TIPE3在氨基酸序列和分子結(jié)構(gòu)上具有較高的同源性，共同組成TIPE蛋白家族。TIPE是該家

3、族中最先被發(fā)現(xiàn)的成員，最初發(fā)現(xiàn)于人頭頸鱗癌，通過差異顯示技術(shù)分析原位頭頸鱗癌細(xì)胞與轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞間差異表達(dá)的基因，發(fā)現(xiàn)SCC-S2基因(即為TIPE)在轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高。隨后，在人體的多種正常組織中均檢測到TIPE分子的表達(dá)，其中脾、淋巴結(jié)、胸腺、甲狀腺、骨髓、胎盤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在脊髓、卵巢、肺、腎上腺、心臟、腦、骨骼肌中表達(dá)較低。另有研究報道，TIPE在人類腫瘤組織中，包括乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌和食管癌中表達(dá)上調(diào)，且與腫

4、瘤的生長轉(zhuǎn)移和預(yù)后具有相關(guān)性。
　　 然而TIPE是否參與肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展過程，目前尚無文獻(xiàn)報道，因此本課題以TIPE為研究對象，探討其在肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用及其分子機(jī)制。
　　 研究目的：
　　 1.研究TIPE在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)變化，分析其臨床意義。
　　 2.探討TIPE在肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制，進(jìn)一步闡明肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病機(jī)理，為臨床生物治療提供潛在的分子靶點(diǎn)。

5、r>　　 研究方法：
　　 1.TIPE基因在肝細(xì)胞肝癌及其相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)水平及臨床意義研究
　　 1.1.TIPEmRNA和TIPE蛋白表達(dá)水平的檢測
　　 收集16例新鮮HCC組織標(biāo)本，用Trizol方法提取癌組織和相應(yīng)癌旁組織的總RNA，RT-PCR方法檢測TIPEmRNA的表達(dá)水平。同時，收集145例HCC石蠟標(biāo)本，用IHC方法檢測癌組織及癌旁組織TIPE蛋白的表達(dá)水平。
　　 1.2.T

6、IPE蛋白的表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析
　　 統(tǒng)計學(xué)分析肝癌組織中TIPE表達(dá)與相應(yīng)臨床指標(biāo)的相關(guān)性（包括腫瘤直徑大小、腫瘤病理分級分期、腫瘤血管淋巴轉(zhuǎn)移及預(yù)后等指標(biāo)）。
　　 2.TIPE分子對肝癌細(xì)胞體內(nèi)外生長的影響
　　 2.1.檢測各種肝癌細(xì)胞系中TIPE表達(dá)情況
　　 Trizol方法提取SMMC7721、QSG7701、HepG2.2.15、HepG2、BEL7402五種肝細(xì)胞系的總RNA，R

7、T-PCR方法檢測TIPEmRNA的表達(dá)水平。
　　 2.2.TIPE對肝癌細(xì)胞生長的影響
　　 取生長狀態(tài)良好的人肝癌細(xì)胞系HepG2和BEL7402，分別轉(zhuǎn)染TIPEsiRNA或陰性對照siRNA(NCsiRNA)，或者在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)TIPE，CCK-8方法繪制生長曲線，觀察TIPE對肝癌細(xì)胞體外生長的影響。
　　 2.3.TIPE對肝癌細(xì)胞體內(nèi)生長的影響
　　 利用小鼠肝癌細(xì)胞系H22建立

8、皮下移植瘤模型，分別瘤內(nèi)注射質(zhì)粒pRK5-mTIPE或pRK5質(zhì)粒，繪制腫瘤的生長曲線;處死小鼠后，分離腫瘤組織，稱瘤重，RT-PCR檢測腫瘤組織中TIPE的表達(dá)。
　　 3.TIPE蛋白對肝癌細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移能力和EMT轉(zhuǎn)化的影響
　　 3.1.利用Transwell小室，分別進(jìn)行體外的遷移和侵襲實(shí)驗(yàn):
　　 分別將TIPEsiRNA或NCsiRNA轉(zhuǎn)染HepG2和BEL7402細(xì)胞，24h后轉(zhuǎn)種于未處理的或預(yù)先鋪

9、Matrigel的transwell小室之上室，染色后顯微鏡下計數(shù)并分析兩組細(xì)胞遷移、侵襲能力的差異。
　　 3.2.TIPE對肝癌細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志分子和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響
　　 結(jié)合文獻(xiàn)報道，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在肝細(xì)胞肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，本課題檢測了TIPE對肝細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志分子和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的。
　　 取狀態(tài)良好的HepG2和BEL7402兩種細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染TIPEsiRNA或

10、NCsiRNA，同時在HepG2中過表達(dá)TIPE，48h后Westernblot檢測EMT相關(guān)分子(E-cadherin，N-cadherin，Vimentin)及轉(zhuǎn)錄因子(Slug，Snail，Twist)的表達(dá)情況。
　　 4.Racl在TIPE調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移中的作用研究
　　 4.1.TIPE對Racl活化的影響
　　 BEL7402細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染TIPEsiRNA或NCsiRNA，或共轉(zhuǎn)染Ras正性突

11、變體H-Ras12V質(zhì)粒。Pull-down試驗(yàn)檢測Racl-GTP水平的變化情況。同時，收取總蛋白檢測總Racl水平。
　　 4.2.Racl在TIPE調(diào)控肝癌生長中的作用
　　 HepG2和BEL7402兩種細(xì)胞分別共轉(zhuǎn)TIPEsiRNA或/和RaclsiRNA或NCsiRNA，CCK-8繪制各組細(xì)胞生長曲線，統(tǒng)計學(xué)分析組間差異。
　　 4.3.Racl參與TIPE調(diào)控肝癌體外轉(zhuǎn)移的作用研究
　　 H

12、epG2和BEL7402兩種細(xì)胞分別共轉(zhuǎn)TIPEsiRNA或/和RaclsiRNA或NCsiRNA，Transwell方法檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.TIPE在肝細(xì)胞肝癌組織中表達(dá)下調(diào)且具有顯著的臨床意義
　　 1.1.肝細(xì)胞肝癌組織中TIPE表達(dá)顯著降低
　　 RT-PCR結(jié)果顯示，所收集的16對HCC組織中，其中有11/16例(69％)癌組織中TIPEmR

13、NA的表達(dá)明顯低于相應(yīng)癌旁組織。IHC結(jié)果顯示:正常肝血管瘤肝組織和癌旁組織均表達(dá)較高水平的TIPE蛋白，而癌組織中TIPE的表達(dá)顯著降低。
　　 1.2.肝癌組織TIPE蛋白的表達(dá)與臨床指標(biāo)具有顯著相關(guān)性
　　 統(tǒng)計學(xué)分析TIPE蛋白表達(dá)與HCC相關(guān)臨床指標(biāo)及患者預(yù)后關(guān)系，結(jié)果顯示TIPE蛋白表達(dá)與腫瘤直徑、病理分級、TNM分期、淋巴管血管侵襲呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，而與患者生存期顯著正相關(guān)。
　　 2.TIPE可在體內(nèi)外

14、顯著抑制肝細(xì)胞肝癌的生長
　　 2.1.肝細(xì)胞系可表達(dá)不同水平的TIPEmRNA
　　 QSG7701、HepG2.2.15，BEL7402細(xì)胞系中TIPEmRNA的表達(dá)相對較高，而HepG2細(xì)胞表達(dá)中等水平的TIPEmRNA。本課題選擇HepG2、BEL7402兩種細(xì)胞系進(jìn)行干擾試驗(yàn)，同時HepG2進(jìn)行了相應(yīng)的過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。
　　 2.2.TIPE可抑制肝癌細(xì)胞系的體外生長
　　 BEL7402細(xì)胞、He

15、pG2細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染TIPEsiRNA及對照siRNA，生長曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TIPEsiRNA可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，而TIPE過表達(dá)則可顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖，提示TIPE具有抑制肝癌細(xì)胞體外增殖的生物學(xué)作用。
　　 2.3.TIPE過表達(dá)可顯著抑制小鼠皮下移植瘤的生長
　　 以小鼠肝癌細(xì)胞系H22制備BALB/c小鼠皮下成瘤模型，成瘤后分別瘤內(nèi)注射pRK5-mTIPE或?qū)φ召|(zhì)粒pRK5。腫瘤生長曲線顯示，pRK5-

16、mTIPE注射組腫瘤生長速度較pRK5注射組顯著減慢，瘤重也明顯減輕。RT-PCR結(jié)果顯示，pRK5-mTIPE注射組腫瘤組織中TIPEmRNA表達(dá)水平顯著高于對照組。
　　 3.TIPE可通過EMT機(jī)制抑制肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力
　　 3.1.TIPE可下調(diào)肝癌細(xì)胞系的體外侵襲遷移能力
　　 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TIPEsiRNA轉(zhuǎn)染組BEL7402細(xì)胞、HepG2細(xì)胞遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)量顯著高于對

17、照組細(xì)胞，而HepG2細(xì)胞中過表達(dá)TIPE之后，細(xì)胞遷移侵襲數(shù)量明顯低于對照組，提示TIPE可抑制肝癌細(xì)胞的體外侵襲遷移能力。
　　 3.2.TIPE可調(diào)控EMT相關(guān)分子及其轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)
　　 鑒于EMT機(jī)制在肝癌轉(zhuǎn)移中的重要作用，研究檢測了TIPE對EMT標(biāo)志分子及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的調(diào)控作用。Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，TIPEsiRNA可下調(diào)上皮標(biāo)志分子E-cadherin的表達(dá)，而明顯上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志分子N-ca

18、dherin、Vimentin，且EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Slug、Snail、Twist亦隨之上調(diào)，TIPE過表達(dá)則發(fā)揮相反的作用。以上結(jié)果提示TIPE可能通過調(diào)控EMT轉(zhuǎn)化，抑制肝癌細(xì)胞侵襲遷移能力。
　　 4.Racl參與TIPE對肝細(xì)胞肝癌生長轉(zhuǎn)移的抑制作用
　　 Racl屬于Ras超家族成員，參與調(diào)控多種生命活動過程，Racl活性的升高在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，課題檢測了TIPE對Racl活化水平的影響，以

19、及Racl在TIPE抑制肝癌生長和轉(zhuǎn)移中的作用。
　　 4.1.TIPE可抑制Racl的活性
　　 Pull-down試驗(yàn)結(jié)果顯示:干擾TIPE表達(dá)之后，細(xì)胞本底水平或Ras正性突變體轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Racl-GTP水平均顯著高于對照組細(xì)胞，提示TIPE可抑制Racl活化。
　　 4.2.Racl參與TIPE對肝癌細(xì)胞生長的抑制作用
　　 HepG2和BEL7402細(xì)胞單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染TIPEsiRNA、Racls

20、iRNA及對照siRNA，生長曲線結(jié)果顯示:TIPEsiRNA可促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長，而RacsiRNA發(fā)揮抑制作用，且可中和TIPEsiRNA對細(xì)胞生長的促進(jìn)作用，提示Racl參與TIPE對肝癌細(xì)胞生長的抑制作用。
　　 4.3.Rael參與TIPE對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用
　　 Transwell結(jié)果顯示TIPEsiRNA可促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移侵襲的能力，而RacsiRNA發(fā)揮抑制作用，且可中和TIPEsiRNA對細(xì)胞侵襲、

21、轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用，提示Racl參與TIPE對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.TIPE分子在肝細(xì)胞肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，并且與腫瘤病理分級、TNM分期、腫瘤大小、預(yù)后有其明顯的相關(guān)性，提示TIPE可能參與肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展過程。
　　 2.TIPE可在體內(nèi)外顯著抑制肝癌細(xì)胞的生長。
　　 3.TIPE具有抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的作用，并且可抑制EMT轉(zhuǎn)換的進(jìn)程。
　　 4.TIP

22、E可負(fù)向調(diào)控Racl的活化，并且參與了TIPE對肝癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用。
　　 創(chuàng)新性和研究意義：
　　 1.首次發(fā)現(xiàn)TIPE在肝細(xì)胞肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，且與臨床指標(biāo)具有顯著相關(guān)性，為充分闡明TIPE蛋白在不同腫瘤發(fā)生中的作用提供重要臨床依據(jù)。
　　 2.首次研究TIPE在肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)TIPE可顯著抑制肝癌生長和轉(zhuǎn)移過程，為肝細(xì)胞肝癌的臨床生物治療藥物研發(fā)提供新的分子靶點(diǎn)。

23、　　 第二部分，CUL4A在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其生物學(xué)作用研究
　　 研究背景：
　　 肝細(xì)胞肝癌是我國發(fā)病率及致死率極高的惡性腫瘤之一，因其惡性度高，治愈率低，預(yù)后差，嚴(yán)重影響人類健康及生活質(zhì)量，一直以來是困擾醫(yī)學(xué)臨床及科研人員的課題，近幾十年來，由于腫瘤分子機(jī)制的不斷深入探索，期待從分子水平上尋找治愈肝細(xì)胞肝癌的靶點(diǎn)已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。
　　 泛素-蛋白酶系統(tǒng)介導(dǎo)蛋白質(zhì)的降解發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，參

24、與細(xì)胞凋亡，炎癥，細(xì)胞增殖與分化，細(xì)胞周期的進(jìn)程，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，抗原遞呈等重要的生命活動過程。泛素-蛋白酶系統(tǒng)對底物蛋白的特異性由泛素連接酶E3所決定的，因此對泛素連接酶生物學(xué)功能的研究引起了極大關(guān)注。近年來，研究證實(shí)泛素連接酶E3在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色。Cullin家族就屬于E3連接酶的范疇，該家族是高度保守的，目前發(fā)現(xiàn)其成員包含CUL1，CUL2，CUL3，CUL4A,CUL4B，CUL5，CUL7七個蛋白。CUL4A作為Cu

25、llin家族成員之一，結(jié)構(gòu)功能與CUL4B有較高的相似性。CUL4A通過與ROC1環(huán)指蛋白、DNA損傷蛋白(DDB1)結(jié)合形成多功能泛素連接酶復(fù)合物，發(fā)揮其靶向降解底物蛋白（如P21，P53，P27等）的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在鱗狀細(xì)胞癌，腎上腺皮質(zhì)腺瘤，兒童成神經(jīng)管細(xì)胞瘤，惡性胸膜間質(zhì)瘤中CUL4A呈高表達(dá)狀態(tài)。另外，CUL4A在肝癌組織及細(xì)胞系中基因拷貝數(shù)增加，但CUL4A在肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展中的具體生物學(xué)作用尚不明確。本課題著手于研究

26、CUL4A在HCC中的表達(dá)及其對肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的調(diào)控作用。
　　 研究目的：
　　 1.臨床標(biāo)本檢測CUL4A在肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)變化，分析其臨床意義，探討其表達(dá)與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系;
　　 2.研究CUL4A在肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用及分子機(jī)制，進(jìn)一步闡明肝癌的發(fā)病機(jī)理，為臨床靶向治療和診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.CUL4A在肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)變化及其

27、臨床意義研究
　　 1.1.CUL4A在肝細(xì)胞肝癌組織及其相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)差異
　　 收集57對HCC及相應(yīng)癌旁組織，IHC方法檢測CUL4A蛋白的表達(dá)情況，評價表達(dá)強(qiáng)度和范圍，計算整體表達(dá)水平，統(tǒng)計學(xué)分析二者之間CUL4A的表達(dá)差異。
　　 1.2.CUL4A表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析
　　 將肝癌組織中CUL4A的表達(dá)水平與相關(guān)臨床指標(biāo)（如:患者年齡、性別、腫瘤大小、病理分級臨床分期、淋巴血管轉(zhuǎn)移

28、以及預(yù)后情況）進(jìn)行了相關(guān)性分析，評價肝癌組織中CUL4A表達(dá)的臨床意義。
　　 2.CUL4A對肝細(xì)胞肝癌體外生長的影響及其分子機(jī)制研究
　　 2.1.CUL4A對肝癌細(xì)胞生長的影響
　　 取生長狀態(tài)良好的HepG2和BEL7402細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染CUL4AsiRNA或?qū)φ誑CsiRNA，CCK-8方法監(jiān)測TIPE對肝癌細(xì)胞生長增殖的影響。
　　 2.2.CUL4A對細(xì)胞周期的調(diào)控作用
　　 Hep

29、G2和BEL7402細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染CUL4AsiRNA或?qū)φ誑CsiRNA，48h后，PI染色、流式細(xì)胞術(shù)檢測CUL4A對細(xì)胞周期進(jìn)程的影響。同時，WesternBlot檢測與腫瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
　　 3.CUL4A對肝細(xì)胞肝癌體外轉(zhuǎn)移能力的影響及其分子機(jī)制
　　 3.1.CUL4A對細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響
　　 分別將CUL4AsiRNA或?qū)φ誑CsiRNA轉(zhuǎn)染HepG2和BEL7402細(xì)胞，T

30、ranswell方法檢測CUL4A對細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響（具體方法同第一部分）。
　　 3.2.CUL4A對EMT相關(guān)分子表達(dá)的調(diào)控作用
　　 進(jìn)行上述transwell實(shí)驗(yàn)的同時，收取細(xì)胞總蛋白，WesternBlot檢測與EMT分子及其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.CUL4A在肝細(xì)胞肝癌組織中表達(dá)上調(diào)且具有顯著的臨床意義
　　 1.1.肝細(xì)胞肝癌組織中TIPE蛋白

31、表達(dá)升高
　　 IHC檢測正常肝血管瘤肝組織及肝癌和相應(yīng)癌旁組織中CUL4A蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示正常肝血管瘤肝組織CUL4A的表達(dá)較低，而肝癌組織中CUL4A的表達(dá)明顯高于相應(yīng)癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 1.2.CUL4A蛋白的表達(dá)水平與肝細(xì)胞肝癌的臨床指標(biāo)顯著相關(guān)
　　 統(tǒng)計學(xué)分析CUL4A表達(dá)與HCC臨床相關(guān)性指標(biāo)以及患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CUL4A表達(dá)與直徑、病理分級、淋巴組織血管侵犯呈正相關(guān)，

32、而與患者生存期呈負(fù)相關(guān)，并且均有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.CUL4A可在體外顯著促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的生長
　　 2.1.CUL4A可促進(jìn)肝癌細(xì)胞系的體外生長能力
　　 BEL7402細(xì)胞、HepG2細(xì)胞經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染CUL4AsiRNA及NCsiRNA之后，CUL4AsiRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力顯著降低，證實(shí)CUL4A的表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長增殖能力。
　　 2.2.CUL4A可肝癌加速肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)

33、程
　　 PI染色結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞相比，經(jīng)CUL4AsiRNA轉(zhuǎn)染的BEL7402、HepG2細(xì)胞，S期比例顯著降低，提示CUL4A可以加速細(xì)胞周期的進(jìn)程，可能在其促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長增殖中發(fā)揮重要作用。
　　 2.3.CUL4A可影響細(xì)胞周期相關(guān)分子的表達(dá)
　　 siRNA沉默BEL7402、HepG2細(xì)胞中CUL4A的表達(dá)后，WB檢測細(xì)胞周期分子的表達(dá)，結(jié)果顯示CUL4AsiRNA可下調(diào)CyclinA，Cy

34、clinB1蛋白的表達(dá)。
　　 3.CUL4A可通過EMT機(jī)制抑制體外肝癌細(xì)胞的侵襲遷移能力
　　 3.1.CUL4A可上調(diào)肝癌細(xì)胞系的體外侵襲遷移能力
　　 Transwell結(jié)果顯示，干擾BEL7402細(xì)胞、HepG2細(xì)胞中CUL4A的表達(dá)，可顯著降低其侵襲、遷移能力，提示CUL4A可參與調(diào)控肝細(xì)胞肝癌的轉(zhuǎn)移過程。
　　 3.2.CUL4A可影響EMT相關(guān)分子及其轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)
　　 將狀態(tài)良

35、好的BEL7402、HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染CUL4AsiRNA后，Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)上皮標(biāo)志分子E-cadherin表達(dá)上調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)志分子N-cadherin，Vimentin表達(dá)下調(diào)。相應(yīng)地，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Slug，Snail，Twist均隨著CUL4A的表達(dá)降低而下調(diào)，提示CUL4A可調(diào)控肝癌細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)化機(jī)制，可能在其促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.肝細(xì)胞肝癌中CUL4A蛋

36、白表達(dá)明顯上調(diào)，且與臨床相關(guān)指標(biāo)有一定相關(guān)性，提示CUL4A在肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。
　　 2.CUL4A可促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的生長及細(xì)胞周期進(jìn)程，可能在肝癌細(xì)胞的惡性增殖過程中發(fā)揮重要作用。
　　 3.CUL4A可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲遷移能力，以及EMT轉(zhuǎn)化機(jī)制，提示CUL4A可能參與肝癌轉(zhuǎn)移過程。
　　 研究意義:
　　 本課題首次研究了CUL4A在肝細(xì)胞肝癌生長和轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)作用，