腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞CGI-58在結(jié)腸癌惡性進(jìn)展中的作用研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是一種常見的消化道惡腫瘤，其發(fā)病率在其他惡性腫瘤中排名第三[1]。像其他實體瘤一樣，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與多種炎性細(xì)胞的介導(dǎo)相關(guān)，其中也包括了巨噬細(xì)胞[2，3]。新近報道稱，浸潤在腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)[4，5]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)活化介導(dǎo)的炎性微環(huán)境在腫瘤惡性進(jìn)展過程中起重要作用。炎性因子促進(jìn)腫瘤的發(fā)展在以往的研究中較多，然而新近研究表明間質(zhì)細(xì)胞的代謝重編程在調(diào)節(jié)腫瘤生物學(xué)中起著至關(guān)重要的作用

2、[6-8]。CGI-58，又名ABHD5，是一種新發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)脂肪分解的輔酶，廣泛表達(dá)于人體各個組織器官中。我們在免疫組化和巨噬細(xì)胞-結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系的實驗中發(fā)現(xiàn)，CGI-58的表達(dá)在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)中是明顯升高的。我們運用本實驗室巨噬細(xì)胞-結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系，特異性敲低巨噬細(xì)胞CGI-58和過表達(dá)巨噬細(xì)胞CGI-58，并運用體內(nèi)和體外實驗證明了巨噬細(xì)胞CGI-58在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響，揭示了巨噬細(xì)胞C

3、GI-58對結(jié)腸癌惡性進(jìn)展的影響。同時我們進(jìn)一步用Western blot和Real-time PCR法來探討其可能的機制，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在CGI-58缺失的情況下，可抑制FOXO1的磷酸化，進(jìn)而增強其轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)IL-1β的表達(dá)。我們的研究以腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)脂質(zhì)代謝異常為切入點，率先解析腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs) CGI-58在慢性炎癥和結(jié)腸癌惡性進(jìn)展的中的作用，研究結(jié)果對于從腫瘤微環(huán)境角度尋找結(jié)腸癌的有效防治策略有重要

4、指導(dǎo)意義。
　　目的:
　　研究腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在CGI-58在結(jié)腸癌惡性進(jìn)展中所起的作用。
　　方法:
　　1.CGI-58在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中的表達(dá)
　　為了研究結(jié)腸癌中的脂代謝重編程與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的關(guān)系，我們運用免疫組化的方法來檢測人類結(jié)腸癌及癌旁組織和小鼠結(jié)腸癌及癌旁組織，并根據(jù)Remmele和stegner提出的免疫反應(yīng)評分（Immunoreactive Score簡稱IRS）來評價免疫組化染

5、色的情況，觀察CGI-58在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的表達(dá)情況。在細(xì)胞水平上，我們運用小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系CT26和MC38的條件上清液來處理巨噬細(xì)胞RAW2647，并用正常培養(yǎng)基處理的RAW2647來做對照，用western blot和Realtime PCR法來檢測不同處理條件下CGI-58的表達(dá)情況。
　　2.腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞CGI-58促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展
　　為了進(jìn)一步研究腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞CGI-58在結(jié)腸癌進(jìn)展中的作用，

6、我們采用慢病毒介導(dǎo)的基因穩(wěn)定敲低或升高RAW264.7中的CGI-58表達(dá)，Western blot分析實驗結(jié)果及使用藥物進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選，以獲得穩(wěn)定的細(xì)胞克隆株。
　　在體外實驗中，分別用收取巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基、巨噬細(xì)胞CGI-58敲低組條件培養(yǎng)基和巨噬細(xì)胞CGI-58過表達(dá)組條件培養(yǎng)基來處理小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26，并分別運用CCK-8、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡AnnexinⅤ FITC、克隆形成實驗來檢測腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞CG

7、I-58是否影響結(jié)腸癌的進(jìn)展。
　　體內(nèi)實驗中，我們將BABL/C小鼠用CT26細(xì)胞系接種上皮下瘤，并分別用巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基和巨噬細(xì)胞CGI-58敲低組條件培養(yǎng)基、巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基和巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基巨噬細(xì)胞CGI-58高表達(dá)組條件培養(yǎng)基來皮下注射瘤周，并觀察腫瘤的大小。
　　3.巨噬細(xì)胞CGI-58促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞惡性增殖的機制初探。
　　我們將巨噬細(xì)胞CGI-58高表達(dá)組、巨噬細(xì)胞CGI-58缺失組、正常巨噬細(xì)胞

8、組及加入FOXO1的抑制AS1842856劑處理的巨噬細(xì)胞組，利用western blot和RealtimePCR法來檢測巨噬細(xì)胞CGI-58對IL-1β和FOXO1的表達(dá)調(diào)控。
　　結(jié)論:
　　1.在免疫組化實驗中，CGI-58的表達(dá)量在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞ATMs中明顯地高于癌旁巨噬細(xì)胞。用小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系CT26、MC38條件培養(yǎng)基處理的巨噬細(xì)胞與正常培養(yǎng)基處理的巨噬細(xì)胞比較，其CGI-58的表達(dá)水平更高。我們得出結(jié)論CG

9、I-58的表達(dá)在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞TAMs中升高的，CGI-58可能在脂質(zhì)聚集較多的TAMs起到了分解作用。
　　2.巨噬細(xì)胞CGI-58敲低條件培養(yǎng)基處理小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26，較巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基，其腫瘤細(xì)胞增殖明顯降低、細(xì)胞周期的G1期增加、克隆形成率較低，而巨噬細(xì)胞CGI-58高表達(dá)組結(jié)果相反。在皮下瘤瘤模型中，我們統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)用巨噬細(xì)胞CGI-58敲低組條件培養(yǎng)基處理的皮下瘤體積較對照巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理組小，小鼠的存活率更

10、高。我們可以得出結(jié)論，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞CGI-58缺失的情況下可以抑制結(jié)腸癌的惡性進(jìn)展。
　　3.巨噬細(xì)胞CGI-58敲低組較之對照組，IL-1β表達(dá)明顯上調(diào)，F(xiàn)OXO1的磷酸化水平降低，提示FOXO1轉(zhuǎn)錄激活;而先前研究表明，F(xiàn)OXO1可調(diào)控IL-1β的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，因此我們推測CGI-58缺失可能通過激活FOXO1蛋白轉(zhuǎn)錄活性而促進(jìn)IL-1β的mRNA水平。而在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中，CGI-58表達(dá)升高，我們猜測:CGI-58/FO