包譜餅對人血清蛋白質(zhì)組學(xué)樣品的制備及胰腺癌腫瘤標(biāo)志物的篩選.pdf

1、蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時(shí)代的一個(gè)新興領(lǐng)域，其理論和技術(shù)的發(fā)展為腫瘤標(biāo)志物的研究提供了新的方向。臨床研究顯示，對惡性腫瘤而言早期診斷的意義遠(yuǎn)大于現(xiàn)有的任何一種治療方案，但現(xiàn)有常用標(biāo)志物對早期無癥狀階段腫瘤的及時(shí)發(fā)現(xiàn)能力仍遠(yuǎn)不能令人滿意。所以尋找靈敏度、特異度均高，檢測方便，無創(chuàng)的標(biāo)志物用于腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷己成為當(dāng)務(wù)之急。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵在于蛋白質(zhì)的分離和鑒定，如何有效去除樣品中高豐度蛋白，分離富集低豐度蛋白，這不僅是蛋白質(zhì)組學(xué)樣品

2、制備重要的研究內(nèi)容，也是制約蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的瓶頸問題。近年來，多維液相色譜(multidimensional HPLC，MDLC)以其分離效率高、重復(fù)性好、方法靈活多樣，且易與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究。本研究應(yīng)用多維色譜和基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization time 0fflight mass spectrometry,MAD

3、LI-TOF MS)離線聯(lián)用對人血清蛋白質(zhì)組學(xué)樣本分離和檢測，并通過該技術(shù)篩選了胰腺癌患者血清和組織中的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，取得了比較滿意的結(jié)果。 本論文包括以下四個(gè)部分： 1.文獻(xiàn)綜述。概括的介紹了蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究的內(nèi)容、方法以及研究現(xiàn)狀，以及目前蛋白質(zhì)組學(xué)在胰腺癌的研究進(jìn)展以及重要意義。 2.疏水型色譜餅對人血清蛋白質(zhì)組學(xué)樣品的快速分離與制備。建立了疏水型色譜餅(10 mm×20 mm LD.)與反相色譜(RP

4、LC)離線二維色譜快速分離制備人血清蛋白質(zhì)組學(xué)樣品，并用基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)進(jìn)行檢測的方法。以四種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的稀溶液為模型進(jìn)行分離富集，得到細(xì)胞色素-C(Cyt-C)與肌紅蛋白(Myo)的檢出限均為1 pmol· L-1，溶菌酶(Lys)和胰島素(Ins)為0.1 pmol·uL-1。將此方法用于人血清蛋白質(zhì)組學(xué)樣品的分離與制備，隨著血清處理量增大，質(zhì)譜可檢出組分與其信號強(qiáng)度均增加，當(dāng)血清處理量達(dá)到

5、l mL時(shí)，可檢出低豐度蛋白質(zhì)或多肽285個(gè)(15 kDa以下)。研究中以Cyt-C為內(nèi)標(biāo)，將其1 g加入到0.5 mL血清中，用上述方法在分離富集所加入的低豐度Cyt-C上取得了很好的效果。以上結(jié)果表明，用疏水型色譜餅與RPLC二維色譜聯(lián)用技術(shù)不僅可對血清樣品中低豐度蛋白進(jìn)行有效的分離和富集，而且一次樣品處理量大，顯著提高了低豐度蛋白的分析、檢測水平。 3.離線體積排阻.反相色譜.質(zhì)譜(SEC-RPLc-MS)對胰腺癌患者血

6、清腫瘤標(biāo)志物篩選的研究。用體積排阻色譜(size exclusion chromatography,SEC)對變性后血清中的蛋白按其分子量的大小進(jìn)行分離并富集，從而消除了高豐度大分子量蛋白質(zhì)對小分子量蛋白/多肽的影響，提高了低豐度小分子量蛋白的檢出率。經(jīng)過反相色譜(reverse phase chromatography,RPLC)進(jìn)一步分離后，并用MALDI-TOF MS在未酶解的情況下直接分析檢測。結(jié)果顯示：該技術(shù)手段重復(fù)性高、穩(wěn)定

7、性好，是較為理想的血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺(tái)，通過對胰腺癌患者術(shù)前、術(shù)后血清的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比分析，并以健康人血清檢測結(jié)果作為對照，篩選出一種顯著差異蛋白分子。這一m/z為5734 D的蛋白質(zhì)/多肽在胰腺癌患者血清中呈現(xiàn)明顯上調(diào)，敏感度達(dá)到78.38％(29/37)，特異度達(dá)到100％(6/6)，有望作為胰腺癌診斷的標(biāo)志物。 4.離線SEC-RPLC-MS對胰腺癌變組織蛋白質(zhì)組樣品的研究。用SEC-RPLC分別對使用兩種不同方法提取的胰