mTORC1-2信號(hào)通路在食管鱗癌中的異常表達(dá)及其靶向干預(yù)研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 mTORC1和mTORC2蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)及意義
　　目的：檢測mTORC1和mTORC2蛋白在人食管鱗癌組織中的表達(dá)情況，分析其與食管鱗癌臨床病理特征之間的關(guān)系。為探索這一疾病發(fā)生的分子機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：58例人食管鱗癌樣本經(jīng)臨床病理分級(jí)分期后，采用免疫組化方法檢測癌組織中mTOR、mTORC1的關(guān)鍵蛋白R(shí)aptor、mTORC

2、2的關(guān)鍵蛋白R(shí)ictor、以及p-Akt（Ser473）的表達(dá)情況，另選取25例正常食管粘膜組織作為對(duì)照。分析上述檢測指標(biāo)與食管鱗癌臨床病理特征之間的關(guān)系，初步探討mTORC1和mTORC2在該疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　結(jié)果：1.mTOR、mTORC1蛋白R(shí)aptor、mTORC2蛋白R(shí)ictor在人食管鱗癌組織中有不同程度的異常表達(dá)。癌組織中mTOR、Raptor以及Rictor的陽性表達(dá)顯著高于正常黏膜組織（p值均<0.0

3、1），表明mTORC1和mTORC2可能與食管鱗癌的發(fā)生有關(guān)。同時(shí)，癌組織中p-Akt（Ser473）的表達(dá)水平與Rictor的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.440，p=0.001），表明在食管鱗癌中mTORC2參與了Akt的Ser473位點(diǎn)磷酸化。2.進(jìn)一步分析顯示，腫瘤分期晚、低分化的癌組織中Raptor的陽性表達(dá)率較相對(duì)應(yīng)的分期較早、分化較好的癌組織顯著升高（p值均<0.05）；而Rictor和p-Akt（Ser473）在腫瘤分期晚、

4、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中陽性表達(dá)顯著升高（p值均<0.05）。
　　結(jié)論：1.mTORC1和mTORC2兩個(gè)復(fù)合物的關(guān)鍵蛋白均在人食管鱗癌組織中異常高表達(dá)。mTORC2蛋白R(shí)ictor與Akt的Ser473位點(diǎn)活化正相關(guān)。2.mTORC1蛋白R(shí)aptor過表達(dá)與食管鱗癌分期較晚和分化低相關(guān)，mTORC2蛋白R(shí)ictor過表達(dá)與食管鱗癌分期較晚以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此，mTORC1和mTORC2的激活可能是這一疾病靶向干預(yù)治療的重要靶

5、點(diǎn)。
　　第二部分 抑制劑靶向干預(yù)mTORC1/2信號(hào)通路對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的：通過使用兩類mTOR阻斷藥物：mTORC1變構(gòu)抑制劑雷帕霉素（第一代mTOR抑制劑）和mTORC1/2激酶抑制劑PP242（第二代mTOR抑制劑），觀察比較靶向抑制mTORC1或雙重靶向抑制mTORC1/mTORC2對(duì)食管鱗癌細(xì)胞下游信號(hào)通路蛋白和生物學(xué)行為包括細(xì)胞增殖、克隆形成能力、凋亡以及周期分布的影響。從而進(jìn)一步明確mT

6、ORC1和mTORC2在食管鱗癌中的作用，并為特異性的靶向mTORC1或mTORC1/2通路治療這一疾病提供臨床前的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：培養(yǎng)人食管鱗癌細(xì)胞Eca-109和TE-1。使用Western-blot方法檢測兩種細(xì)胞中mTOR及其下游底物蛋白p70S6K、4E-BP1、Akt的活化情況，以及經(jīng)雷帕霉素和PP242處理后上述活化蛋白的表達(dá)改變。MTT方法檢測不同濃度的雷帕霉素和mTORC1/2激酶抑制劑PP242和Ku-0

7、063794對(duì)食管鱗癌細(xì)胞Eca-109和TE-1增殖的影響。克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度的雷帕霉素和PP242對(duì)食管鱗癌細(xì)胞Eca-109和TE-1克隆形成的影響。流式細(xì)胞技術(shù)和Western Blot技術(shù)檢測雷帕霉素和PP242對(duì)食管鱗癌細(xì)胞Eca-109和TE-1細(xì)胞周期分布和凋亡的影響。
　　結(jié)果：1.mTOR及其活化形式p-mTOR在食管鱗癌細(xì)胞Eca-109和TE-1中均有表達(dá)，mTORC1下游底物蛋白p70S6K、4E-

8、BP1及mTORC2下游底物蛋白Akt(Ser473位點(diǎn))在兩種細(xì)胞中均活化。雷帕霉素處理后，Eca-109和TE-1細(xì)胞中p-mTOR(Ser2448)和p-p70S6K(Thr389)的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低，而p-Akt(Ser473)與p-4E-BP1(Thr37/46)的水平較對(duì)照沒有下降。PP242既能降低兩種細(xì)胞中p-mTOR和p-p70S6K的表達(dá)水平，同時(shí)也能降低pAkt和p-4E-BP1的水平。2.雷帕霉素、PP2

9、42可以有效抑制食管鱗癌細(xì)胞Eca-109和TE-1增殖以及克隆形成，其中PP242抑制效應(yīng)較雷帕霉素明顯。3.雷帕霉素、PP242均可誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞G0/G1周期阻滯，其中PP242作用更明顯。4.PP242能顯著增加兩種細(xì)胞凋亡的數(shù)目，并增強(qiáng)活化狀態(tài)的PARP(Cleaved-PARP)表達(dá)，雷帕霉素沒有此作用。
　　結(jié)論：1.mTORC1/2下游底物蛋白在食管鱗癌細(xì)胞中活化。雙重mTORC1/2激酶抑制劑PP242對(duì)其下游

10、信號(hào)通路有明顯抑制作用，而mTORC1抑制劑雷帕霉素僅能阻斷部分mTORC1的活性。2.雷帕霉素和PP242均可抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖，降低克隆形成率，誘導(dǎo)周期阻滯，其中PP242效果更明顯。PP242而不是雷帕霉素能夠誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞凋亡。因此，靶向抑制mTOR信號(hào)通路在食管鱗癌中具有潛在的抗腫瘤效果，其中雙重靶向mTORC1/2較靶向mTORC1信號(hào)通路可能有更大的優(yōu)勢。
　　第三部分 mTORC1/2信號(hào)通路抑制劑與順鉑在食管

11、鱗癌細(xì)胞中的聯(lián)合作用
　　目的：順鉑是傳統(tǒng)的化療藥物，有效的聯(lián)合治療在減輕其毒性反應(yīng)的同時(shí)，還可能增強(qiáng)藥物的療效。本部分研究將觀察順鉑單用或聯(lián)合mTORC1/2靶向抑制劑對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。初步探討順鉑和mTOR干預(yù)藥物聯(lián)合作用增效的可能機(jī)制。
　　方法：培養(yǎng)人食管鱗癌細(xì)胞Eca-109，用不同濃度的順鉑單用或者聯(lián)合雷帕霉素或PP242處理后，以MTT法檢測不同藥物單用和聯(lián)合使用對(duì)Eca-109細(xì)胞增殖的抑制作用

12、。流式細(xì)胞技術(shù)和Western Blot技術(shù)檢測順鉑單用或者聯(lián)合PP242對(duì)Eca-109細(xì)胞和TE-1細(xì)胞凋亡的影響。Western-Blot技術(shù)檢測單藥或聯(lián)合用藥對(duì)Eca-109細(xì)胞中Akt及其活化水平的影響。
　　結(jié)果：1.順鉑抑制食管鱗癌細(xì)胞Eca-109增殖，并呈濃度依賴性。PP242與順鉑聯(lián)合作用能夠顯著增加順鉑對(duì)Eca-109細(xì)胞的抑制作用，兩者聯(lián)合具有協(xié)同效應(yīng)。2.PP242聯(lián)合順鉑顯著增強(qiáng)了單藥誘導(dǎo)的Eca-10

13、9和TE-1細(xì)胞的凋亡（p<0.05）。3.順鉑單獨(dú)作用后Akt的活化形式p-Akt(Ser473)升高，而與PP242聯(lián)合作用后，p-Akt(Ser473)水平下降，提示PP242可能有效抑制了順鉑誘導(dǎo)的Akt磷酸化。
　　結(jié)論：1.雙重mTORC1/2抑制劑PP242與順鉑聯(lián)合應(yīng)用，能夠增強(qiáng)順鉑對(duì)食管鱗癌細(xì)胞Eca-109的抑制作用，促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。兩者聯(lián)合具有協(xié)同效應(yīng)。2.PP242和順鉑協(xié)同作用的機(jī)制可能與PP24