結(jié)締組織生長因子對胃癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移的影響及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:構(gòu)建CTGF真核表達(dá)載體pcDNA3.1-CTGF及其陰性對照pcDNA3.1-EGFP，轉(zhuǎn)染相對低表達(dá)CTGF的胃癌細(xì)胞，觀察上調(diào)CTGF表達(dá)水平對胃癌細(xì)胞增殖及侵襲遷移的影響，并利用表達(dá)譜芯片分析差共同的差異表達(dá)基因。
　　方法:提取胃癌細(xì)胞(AGS、SGC-7901、MKN-45和BGC-823)總RNA，利用PCR技術(shù)檢測胃癌細(xì)胞系CTGFmRNA表達(dá)水平差異。構(gòu)建pcDNA3.1-CTGF表達(dá)載體，運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)

2、對相對低表達(dá)CTGF的胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染經(jīng)測序鑒定后的pcDNA3.1-CTGF和pcDNA3.1-EGFPD表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CTGF質(zhì)粒的作為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP的細(xì)胞作為陰性對照，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞經(jīng)過G418篩選，Q-PCR, western blot鑒定，選擇CTGF表達(dá)最高的實(shí)驗(yàn)組和表達(dá)最低的陰性對照組，通過MTT、trans-well實(shí)驗(yàn)，分析轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CTGF后胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的

3、變化。利用安捷倫表達(dá)譜芯片分析轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CTGF前后基因表達(dá)變化并進(jìn)行差異聚類分析，并對差異明顯基因進(jìn)行PCR檢測驗(yàn)證。
　　結(jié)果:1.胃癌細(xì)胞系CTGF mRNA相對表達(dá)水平BGC-823＞SGC-7901＞AGS＞MKN-45
　　2.成功構(gòu)建了pcDNA3.1-CTGF真核表達(dá)載體及陰性表達(dá)載體pcDNA3.1-EGFP。
　　3.通過重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染、RT-qPCR檢測，成功獲得CTGF表達(dá)水平最

4、高的實(shí)驗(yàn)組(MKN45-CTGF、AGS-CTGF、SGC7901-CTGF)和表達(dá)最低的Negative control組(MKN45-EGFP、AGS-EGFP、 SGC7901-EGFP)細(xì)胞。
　　4.MTT實(shí)驗(yàn)顯示，72h后，實(shí)驗(yàn)組相對增殖率分別是對應(yīng)Negative control的1.37、1.47、1.64倍。遷移實(shí)驗(yàn)表明，24小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組穿過膜的細(xì)胞數(shù)達(dá)到140.7±17.2、132.7±12.0、146.0±1

5、3.9個(gè);Negative control組穿過膜的細(xì)胞數(shù)為74.3±9.6、83.0±8.0、93.3±11.5個(gè);實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞穿膜個(gè)數(shù)分別是Negative control穿膜個(gè)數(shù)的1.89、1.60、1.57倍。侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，48小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組穿過膜的細(xì)胞數(shù)達(dá)到87.3±t2.7、70.7±19.1、69.3±11.7個(gè);Negative control組穿過膜的細(xì)胞數(shù)為54.7±8.1、35.0±11.5、37.3±4.0個(gè);實(shí)驗(yàn)組

6、細(xì)胞穿膜個(gè)數(shù)分別是Negative control穿膜個(gè)數(shù)的1.60/2.02/1.86倍。
　　5.表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組各細(xì)胞VASP基因表達(dá)水平均明顯增高，標(biāo)準(zhǔn)化后的VASP基因表達(dá)水平分別是Negative control的2.242、3.907、3.151倍。PCR檢測顯示實(shí)驗(yàn)組VASPmRNA表達(dá)水平分別是Negative control的2.09、3.23、3.84;是Normal control的18.2、9.3