RNA干擾抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞功能影響的研究.pdf

1、瘢痕疙瘩是皮膚損傷如創(chuàng)傷、燒傷或手術(shù)后引發(fā)的過(guò)度纖維化。病變常蔓延至正常皮膚，嚴(yán)重?fù)p害容貌外觀，造成功能障礙，不發(fā)生退行變化和單純手術(shù)切除后極易復(fù)發(fā)。臨床上治療方法雖然很多，但療效不佳。 CTGF是一種重要的促纖維化因子，通過(guò)SMADs途徑參與病理性瘢痕的形成，阻斷CTGF的產(chǎn)生及其促纖維化效應(yīng)可能為今后病理性瘢痕的治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。有研究報(bào)道，利用CTGF反義寡核苷酸能夠抑制HKFs的增殖、CTGF蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)

2、、膠原合成。 RNA干擾是利用與目的mRNA具有同源性的siRNA誘發(fā)序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，它產(chǎn)生類似于“基因敲除”的生物表型，能夠高效、特異地抑制靶基因。有報(bào)道能夠代替基因打靶技術(shù)，應(yīng)用于臨床治療相關(guān)疾病。 目的： 運(yùn)用生物信息學(xué)方法，構(gòu)建CTGFsiRNA干擾質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后誘發(fā)RNAi，觀察其對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞CTGF表達(dá)和膠原蛋白分泌的影響，并探討其機(jī)制，為瘢痕疙瘩的基因治療提供了一條新的

3、思路。 方法： 根據(jù)RNAi設(shè)計(jì)原則，運(yùn)用生物信息學(xué)方法，篩選出3條靶序列，分別合成3對(duì)64nt寡核苷酸，另以一條同樣GC比例的錯(cuò)亂序列作為陰性對(duì)照，經(jīng)與BamHI和HindⅢ酶切的線性化質(zhì)粒pGenesil-1定向連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，質(zhì)粒分別命名為pGenesil-CTGF1、pGenesil-CTGF2、pGenesil-CTGF3，pGenesil-CTGF4。質(zhì)粒擴(kuò)增后經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定。 為提高轉(zhuǎn)

4、染效率，使用Roche公司的Dosper脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染篩選實(shí)驗(yàn)分為六組：對(duì)照組(單純DMEM培養(yǎng)基+脂質(zhì)體)；空質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染pGenesil-1空質(zhì)粒)；pGenesil-CTGF1組；pGenesil-CTGF2組；pGenesil-CTGF3組；pGenesil-CTGF4組。細(xì)胞經(jīng)G-418篩選后，得到細(xì)胞克隆，逐步擴(kuò)大培養(yǎng)。 使用熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中CTGFmRNA水平、Westernblotting半定量

5、檢測(cè)CTGF蛋白水平、H3-脯氨酸滲入法檢測(cè)膠原蛋白含量。 分別用10ng/ml劑量TGF-β1刺激抑制效率最高的干擾質(zhì)粒組細(xì)胞和未經(jīng)轉(zhuǎn)染的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，觀察從形態(tài)學(xué)、CTGFmRNA、CTGF蛋白和膠原蛋白含量方面觀察對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的影響。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建CTGF基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，測(cè)序證實(shí)插入序列正確。 2.轉(zhuǎn)染pGenesil-CTGF1、pGenesil-CTGF2干擾質(zhì)粒的瘢痕疙

6、瘩成纖維細(xì)胞CTGFmRNA表達(dá)水平的抑制效率分別是59.9％、20.4％(P＜0.05)，pGenesil-CTGF3干擾質(zhì)粒的抑制效率明顯不佳(9.09％)，在前兩組干擾質(zhì)粒組中，尤以pGenesil-CTGF1組抑制效果最佳。pGenesil-CTGF1干擾質(zhì)粒對(duì)CTGF蛋白和膠原蛋白的抑制率分別達(dá)33.6％和49.7％(P＜0.05)。這說(shuō)明構(gòu)建siRNA干擾質(zhì)?？捎行б种葡鄳?yīng)基因和蛋白的表達(dá)水平，其抑制效果的差異與靶序列有關(guān)。

7、 3.經(jīng)TGF-β1刺激后，發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的CTGFmRNA水平明顯升高2倍多，但轉(zhuǎn)染了pGenesil-CTGF1干擾質(zhì)粒的細(xì)胞雖經(jīng)TGF-β1刺激，CTGFmRNA水平也只有未經(jīng)刺激細(xì)胞的56.6％，與刺激后的正常細(xì)胞相比明顯降低(P＜0.05),CTGF蛋白水平、膠原蛋白含量與刺激后相比也明顯降低33.6％、49.7％(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.針對(duì)CTGF基因的siRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成

8、纖維細(xì)胞后能明顯抑制CTGFmRNA表達(dá)，降低CTGF蛋白含量，提示該基因可作為基因治療的靶點(diǎn)； 2.針對(duì)CTGF基因不同位點(diǎn)的siRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，能夠不同程度地抑制CTGF基因表達(dá)，其抑制效果和靶序列的位置有關(guān)； 3.經(jīng)TGF-β1刺激后，轉(zhuǎn)染pGenesil-CTGF干擾質(zhì)粒的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞CTGFmRNA、CTGF蛋白和膠原蛋白含量與與未經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比明顯降低，但與未經(jīng)刺激的細(xì)胞相比，仍未到基線水平，