脂聯(lián)素對結(jié)締組織生長因子介導(dǎo)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的調(diào)控機制研究.pdf

1、目的:瘢痕疙瘩是遺傳素質(zhì)的個體皮膚創(chuàng)傷愈合的過程中，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(keloid fibroblasts，KFs)異常增殖，Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)過度沉積導(dǎo)致的纖維過度增生性疾病。瘢痕疙瘩的發(fā)病機制尚不明確，現(xiàn)有的研究表明各種細(xì)胞因子、生長因子，比如轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)

2、、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGF)和血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)等在瘢痕疙瘩發(fā)病過程中發(fā)揮重要的作用，而細(xì)胞因子和生長因子的作用和意義也越來越受到國內(nèi)外研究者們的重視。
　　結(jié)締組織生長因子(connective

3、tissue growth factor, CTGF)是目前研究得較多的一種細(xì)胞因子，CTGF屬于CCN家族成員，廣泛表達(dá)于體內(nèi)多種組織和器官，在瘢痕疙瘩組織中可被誘導(dǎo)而高度表達(dá)，并作為TGF-β的下游效應(yīng)因子或者不依賴于TGF-β而單獨作用，從而刺激成纖維細(xì)胞的活化、增殖和遷移，并促進(jìn)ECM的過度累積，是瘢痕疙瘩增殖的必要因素及維持瘢痕疙瘩纖維化的關(guān)鍵生長因子。由于CTGF的生物學(xué)效應(yīng)單一，因此，阻斷CTGF的表達(dá)或者抑制其活性將可能

4、成為治療瘢痕疙瘩的有效方法。
　　脂聯(lián)素是一種由脂肪細(xì)胞分泌的新型脂肪因子，廣泛表達(dá)于人體的各種組織和器官，在外周血中濃度較高。目前已研究證實人體內(nèi)存在四個脂聯(lián)素的受體(adiponectin receptors, adipoRs)，即adipoR1、adipoR2、T-鈣黏蛋白(T-cadherin)和鈣網(wǎng)織蛋白(calreticulin)，脂聯(lián)素通過與其受體adipoRs結(jié)合后，活化腺苷酸活化的蛋白激酶(Adenosine5'

5、-monophosphate activated protein kinase，AMPK)、絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl-inositol3-kinase，PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(serine threonineprotein kinase，Akt)等多種信號通路，在調(diào)節(jié)高血壓、糖尿病、高血脂和動脈粥樣硬化等肥胖

6、相關(guān)的代謝性疾病過程中發(fā)揮重要的作用。此外，脂聯(lián)素可以作為負(fù)性調(diào)控因子，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫、抑制細(xì)胞增殖、遷移和炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
　　目前關(guān)于脂聯(lián)素在瘢痕疙瘩的相關(guān)研究尚未見報導(dǎo)，然而最近研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可抑制多種組織器官及皮膚組織的纖維化進(jìn)程，由于炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和遷移增加及凋亡下降是瘢痕疙瘩致病的重要病理基礎(chǔ)，而皮膚組織纖維化是瘢痕疙瘩疾病進(jìn)程的重要特征之一，因此，脂聯(lián)素可能在瘢痕疙瘩的發(fā)病過程中發(fā)揮一定的作用。

7、>　　本研究旨在通過研究脂聯(lián)素對CTGF誘導(dǎo)的KFs增殖、遷移和ECM產(chǎn)生的影響及其作用機制，探討脂聯(lián)素在瘢痕疙瘩發(fā)病過程中的可能作用。
　　方法:臨床收集瘢痕疙瘩患者和正常健康對照者的皮膚組織，采用組織塊貼塊法原代離體培養(yǎng)KFs和正常皮膚成纖維細(xì)胞(normal dermal fibroblasts，NFs)，用波形蛋白vimentin和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)對培養(yǎng)的成纖維細(xì)

8、胞進(jìn)行鑒定，選取3～5代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實驗。
　　采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)、實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，real-time PCR)、蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot)和細(xì)胞免疫熒光的方法檢測KFs中脂聯(lián)素及adipoRs的表達(dá)，并以NFs作對

9、照。收集的瘢痕疙瘩和正常皮膚組織制備成石蠟切片，觀察瘢痕疙瘩和正常皮膚組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的差別，并以組織免疫組化法檢測兩種組織中adipoRs的表達(dá)及分布。
　　以不同濃度CTGF(0、2 ng/ml、4 ng/ml、6 ng/ml、8 ng/ml和12 ng/ml)和時間點(0 h、2h、6h、12h、24 h、48 h)刺激KFs、NFs，采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8(CellCounting Kit-8，CCK-8)檢測KFs、NFs的

10、細(xì)胞活性，選擇CTGF的最佳作用濃度和時間。以外源性CTGF刺激KFs、NFs24 h，采用CCK-8的方法檢測細(xì)胞增殖、Transwell檢測細(xì)胞遷移，觀察脂聯(lián)素對CTGF刺激的KFs和NFs細(xì)胞增殖和遷移作用的影響;以real-time PCR和western blot的方法檢測脂聯(lián)素對CTGF刺激的KFs和NFs中Ⅰ型膠原、FN及α-SMA的基因和蛋白表達(dá)水平的影響。
　　采用RNA干擾(RNA interference，R

11、NAi)技術(shù)，誘導(dǎo)adipoRs基因沉默，并加入外源性CTGF和脂聯(lián)素刺激KFs24 h，以CCK-8檢測細(xì)胞增殖，Transwell檢測細(xì)胞遷移，real-time PCR檢測Ⅰ型膠原、FN及α-SMA的基因表達(dá)水平。
　　外源性CTGF和脂聯(lián)素刺激KFs24 h，western blot檢測AMPK、MAPK和PI3K-Akt通路的磷酸化水平;在此基礎(chǔ)上，加入AMPK、p-38MAPK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-

12、terminal kinase，JNK)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellularsignaling regulatory protein kinase，ERK)和Akt的通路阻滯劑，CCK-8檢測細(xì)胞增殖、Transwell檢測細(xì)胞遷移，real-time PCR檢測Ⅰ型膠原、FN及α-SMA基因的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:瘢痕疙瘩組織表皮厚度顯著高于正常皮膚組織，并有較多的炎性細(xì)胞浸潤和大量的膠原纖維。vimentin和

13、α-SMA免疫染色證實所培養(yǎng)的是成纖維細(xì)胞。與正常皮膚組織相比，脂聯(lián)素及其四個受體adipoR1、adipoR2、T-cadherin和calreticulin從組織水平、細(xì)胞水平、蛋白及基因水平在瘢痕疙瘩中的表達(dá)均明顯下降。
　　外源性CTGF可呈時間和濃度依賴方式促進(jìn)KFs增殖，在6 ng/ml和24 h時達(dá)峰值，這一作用能被脂聯(lián)素所抑制，在5tg/ml時作用最明顯;同樣，脂聯(lián)素能夠抑制CTGF誘導(dǎo)的KFs遷移和KFs中Ⅰ型膠

14、原、FN及α-SMA的基因和蛋白水平的表達(dá)，而對NFs的作用不明顯。
　　脂聯(lián)素抑制CTGF刺激的KFs中APMK、p-38MAPK和ERK的通路磷酸化，而對JNK和Akt的磷酸化無明顯影響;脂聯(lián)素抑制CTGF誘導(dǎo)的KFs增殖、遷移和ECM的累積作用能被Compound C(APMK通路阻斷劑)、SB203580(p-38MAPK通路阻斷劑)和PD98059(ERK通路阻斷劑)和小干擾RNA(small interfering R