結(jié)締組織生長因子對胰腺癌細胞和臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖和凋亡影響的作用機制探討.pdf

1、目的： 第一部分：構(gòu)建人結(jié)締組織生長因子(CTGF)基因真核表達載體，并在哺乳類Cos7細胞中獲得表達，其表達產(chǎn)物具有促進臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)增殖的生物活性。從而為進一步研究CTGF基因在血管新生和腫瘤中的作用奠定基礎(chǔ)。 第二部分：(1)探討TGFβ1、內(nèi)源性CTGF、外源性CTGF對胰腺癌細胞Panc-1增殖、凋亡以及細胞周期的影響。(2)研究CTGF在胰腺癌細胞Panc-1中的表達情況以及TGFβ1對CTG

2、F基因表達的影響。(3)探討CTGF單克隆抗體對TGFβ1促凋亡的抑制作用。(4)研究CTGF促進胰腺癌細胞Panc-1凋亡的作用機制，探討CTGF的表達與胰腺癌細胞增殖和凋亡的關(guān)系。 第三部分：(1)CTGF對HUVECs增殖的影響;(2)探討CTGF對HUVECs細胞磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI-3K/PKB)信號傳導(dǎo)通路的激活作用以及PI-3K抑制劑(LY294002)對其影響;(3)研究CTGF對HUVECs細胞細

3、胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號通路的影響以及p-ERK抑制劑(U0126)對其影響。 方法： 第一部分：根據(jù)人CTGF基因的cDNA序列，設(shè)計合成一對5，端分別含有XbaⅠ和HindⅢ酶切位點的特異性引物，運用RT-PCR方法擴增HUVECs中CTGF，回收PCR產(chǎn)物，并將其連接至克隆載體PMD-18T中。重組的PMD-18T在大腸桿菌DH5α內(nèi)擴增后，經(jīng)質(zhì)粒提取、XbaⅠ和HindⅢ酶切，篩選出陽性重組子，并測序鑒定基

4、因。瓊脂糖凝膠電泳回收含有CTGFcDNA全長的酶切片段，然后在DNA連接酶作用下將其與真核表達載體pcDNA3.1(-)連接。重組質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ和HindⅢ酶切予以鑒定。并將其轉(zhuǎn)染到Cos7細胞中，用westernblotting法證實其表達。以MTT檢測轉(zhuǎn)染上清對HUVECs的增殖影響。 第二部分：脂質(zhì)體介導(dǎo)CTGF真核表達載體pcDNA3.1瞬時轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞系Panc-1。MTT法檢測胰腺癌細胞的增殖情況。流式細胞儀檢測

5、胰腺癌細胞系Panc-1的凋亡情況以及細胞周期的變化。RT-PCR和Westernblot法檢測外源性CTGF刺激后細胞內(nèi)的Bcl-2和Bax的基因和蛋白的表達情況。以及RT-PCR法檢測TGFβ1對CTGF基因表達的影響。 第三部分：應(yīng)用免疫磁珠篩選臍靜脈內(nèi)皮細胞，免疫組織化學(xué)法和電鏡鑒定內(nèi)皮細胞，MTT法鑒定結(jié)締組織生長因子對內(nèi)皮細胞增殖的影響，流式細胞儀測定CTGF對內(nèi)皮細胞周期的影響。以WesternBlot法檢測一定濃

6、度(100ng/ml)CTGF作用于HUVECs不同時間0min，15min，30min，60min后和不同濃度(0、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml和100ng/ml)CTGF作用HUVECs細胞一定時間(30min)后ERK、p-ERK、Akt、p-Akt蛋白的變化以及用同法檢測PI-3K抑制劑LY294002以及p-ERK抑制劑U0126分別對CTGF作用于p-ERK和p-Akt的影響。 結(jié)論： 1.

7、成功構(gòu)建人結(jié)締組織生長因子CTGF基因的真核表達載體。并且其表達產(chǎn)物具有促進靜脈內(nèi)皮細胞增殖的活性。 2.TGFβ1促進內(nèi)皮細胞凋亡可能與CTGF的表達有關(guān)，而CTGF的作用可顯著抑制胰腺癌細胞的增殖能力和促進其凋亡，并且這種促凋亡機制可能與Bax的表達有關(guān)。 3.CTGF可通過非轉(zhuǎn)錄效應(yīng)，迅速激活HUVECs細胞的PI-3K/Akt信號傳導(dǎo)通路以及ERK信號通路。LY294002和U0126可抑制CTGF對此通路的激活