抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒藥物的高通量篩選方法的建立.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是一種以妊娠母豬繁殖障礙和生長仔豬呼吸道癥狀為主要臨床特征的傳染病，其病原體為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)。PRRSV屬于動脈炎病毒科(Arterivirus)，為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒。該病毒具有高度的變異性，易形成異源的種群，目前沒有有效的疫苗和藥物進(jìn)行防治。本研究利用PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白加工成熟時(shí)的特異性切割序列，構(gòu)建螢火蟲熒光素酶系統(tǒng)指示PRRSV的增殖水平，并通過多種抑制劑和藥物進(jìn)行

2、驗(yàn)證，擬為抗PRRSV藥物的篩選建立一種新型的藥物高通量篩選方法。具體研究內(nèi)容如下:
　　1、確定最佳的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)
　　本研究將PRRSV12個非結(jié)構(gòu)蛋白的切割序列分別與螢火蟲熒光素酶融合表達(dá)，構(gòu)建了12個熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，建立PRRSV感染增殖指示生物傳感器。將報(bào)告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，在PRRSV感染細(xì)胞的過程中，病毒的蛋白酶會切割這些特異性的序列，從而激活該熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)。根據(jù)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)激活的

3、程度，篩選到最佳的熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)為358-DnaE-Nsp3/4。
　　2、熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的特異性和敏感性分析
　　為了驗(yàn)證358-DnaE-Nsp3/4熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的特異性和敏感性，本研究將PRRSV編碼的蛋白酶Nsp4和358D-Nsp3/4報(bào)告質(zhì)粒在HEK-293T細(xì)胞中共表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Nsp4能切割該報(bào)告質(zhì)粒中的特異性序列，激活熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)。將Nsp4蛋白酶活性中心的3個氨基酸進(jìn)行特異性突變，使其切割活性喪失

4、，將突變體與358D-Nsp3/4報(bào)告質(zhì)粒在HEK-293T細(xì)胞中共表達(dá)，發(fā)現(xiàn)突變體不能激活熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，表明該熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)是特異性依賴PRRSV編碼的蛋白酶Nsp4的活性。通過PRRSV、PRV和TGEV感染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)僅PRRSV感染能激活該熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，表明該系統(tǒng)能特異性的指示PRRSV的感染和增殖。此外，PRRSV感染激活該熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的能力具有劑量依賴性，表明該系統(tǒng)還能對PRRSV的增殖情況進(jìn)行定量分析。

5、　　3、熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)在抗PRRSV藥物篩選中的應(yīng)用
　　將358D-Nsp3/4熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)與NSP4共轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞后，加入4種不同的藥物，分別是EPDTC、RID、AMA與RUP。發(fā)現(xiàn)只有EPDTC與RUP能抑制熒光素酶的活性，表明這2種蛋白酶抑制劑能抑制該報(bào)告系統(tǒng)的活性。將358D-Nsp3/4熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Marc-145細(xì)胞中，PRRSV感染后分別加入不同的藥物，同時(shí)，以噬斑減數(shù)試驗(yàn)檢測藥物處