基于穿透肽技術(shù)的高通量多肽藥物篩選系統(tǒng)的建立.pdf

1、炎癥(inflammation)是一種廣泛的病理生理反應(yīng)，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，如膿毒血癥、系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征、缺血再灌注損傷等常常伴隨劇烈的急性炎癥反應(yīng)。慢性炎癥是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性骨病、慢性炎性腸病、脂肪沉積性動脈粥樣硬化、以及某些癌癥的主要病因。積極治療和控制炎癥是多種疾病治愈的關(guān)鍵。目前，有許多針對炎癥治療的生物制劑，如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL

2、-1)和腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α)的特異性抗體、自由基清除劑、蛋白酶抑制劑、黏附分子抗體等，這些藥物雖然在細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)中取得了一定療效，但臨床應(yīng)用都未達(dá)到理想療效。因此，當(dāng)前迫切需要尋找和研制更加有效的治療炎癥的藥物。 炎癥的一個(gè)重要特征是其發(fā)生和發(fā)展過程中會激活大量炎癥相關(guān)因子基因的表達(dá)，如趨化因子、黏附分子、細(xì)胞因子、蛋白酶、環(huán)氧合酶(cyclooxygenases，

3、COX)和一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)等。細(xì)菌的代謝產(chǎn)物L(fēng)PS以及主要的致炎細(xì)胞因子(IL-1，TNF-α)作用于機(jī)體細(xì)胞時(shí)，通過細(xì)胞表面特異性受體的介導(dǎo)可將信號傳遞入細(xì)胞內(nèi)，通過調(diào)節(jié)炎癥過程中眾多基因的表達(dá)，引發(fā)大量炎性因子的釋放。雖然激活釋放的炎性因子的數(shù)量非常龐大，但是在激活炎性因子基因表達(dá)過程中的上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路卻是相對有限的，所以，這就提示我們?nèi)绻槍@些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的特定信號分子為藥物靶點(diǎn)

4、，通過調(diào)節(jié)它們的活性來抑制炎性基因的表達(dá)，就可以有效的控制炎癥的發(fā)生和發(fā)展。 在生物體內(nèi)調(diào)節(jié)某一生物大分子功能活性的方式有很多種，但最有效的途徑是通過直接干預(yù)其基因表達(dá)的過程?；虮磉_(dá)調(diào)控的基本形式是通過蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用來實(shí)現(xiàn)，而蛋白質(zhì)的作用往往是由組成其結(jié)構(gòu)的多肽的功能來體現(xiàn)。因此，近年來利用功能性多肽模擬蛋白質(zhì)的功能作為藥物進(jìn)行治療成為一種新趨勢。 我們設(shè)想在體外將一些功能性多肽運(yùn)送入培養(yǎng)的

5、真核細(xì)胞中，通過研究這些多肽對炎癥中特定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子基因表達(dá)的調(diào)控作用，尋找和篩選新的抗炎多肽，進(jìn)而為炎癥治療提供新的供選藥物，為炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)理提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 但是要實(shí)現(xiàn)上述目的，必須解決以下幾個(gè)問題：(1)必須有一種工具能有效的攜帶外源的多肽進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而又不影響細(xì)胞的形態(tài)和功能。(2)多肽進(jìn)入細(xì)胞后，能夠通過核膜上的核孔復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核。(3)有一種簡捷、方便、有效的手段來觀察和研究多肽在細(xì)胞內(nèi)的行為。(4)能

6、夠以一種簡便、經(jīng)濟(jì)的方式得到研究所需的可供篩選的候選多肽。 為了滿足上述實(shí)驗(yàn)研究的要求，我們利用點(diǎn)突變PCR技術(shù)在本室已有的兩個(gè)原核表達(dá)載體pET14b-His-EGFP、pET14b-His-MCStop/EGFP的基礎(chǔ)上引入來源于Kaposi肉瘤成纖維細(xì)胞生長因子(Kaposifibroblastgrowthfactor，K-FGF)信號肽疏水區(qū)的稱為膜穿透序列膜轉(zhuǎn)位序列(membrane-permeable/translo

7、cationsequence，MPS/MTS)的細(xì)胞穿透肽(cellpenetratingpeptide，CPP)序列、SV40大T抗原的核定位信號序列(nuclearlocalizationsequence，NLS)，分別構(gòu)建了細(xì)胞穿透肽位于融合蛋白氨基末端和羧基末端的兩個(gè)靶向細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)牡鞍妆磉_(dá)載體。經(jīng)酶切、測序驗(yàn)證載體構(gòu)建正確后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)表達(dá)菌株，表達(dá)純化后得到融合蛋白，然后將融合蛋白直接加入培養(yǎng)的真核細(xì)胞，

8、利用熒光顯微鏡觀察和Westernblot檢測對融合蛋白的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)功能及內(nèi)化行為進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞穿透肽位于融合蛋白氨基末端和羧基末端的兩個(gè)融合蛋白均可以有效的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并且對細(xì)胞的毒性非常小。融合蛋白內(nèi)化后細(xì)胞內(nèi)定位的動態(tài)觀察表明，熒光標(biāo)記的融合蛋白在加入細(xì)胞15min后就可以穿透細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞內(nèi)，熒光起始主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，然后隨時(shí)間的延長逐漸向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，但融合蛋白內(nèi)化后入核布完全，有部分蛋白停留在核周與胞漿。對其運(yùn)輸動力學(xué)

9、的檢測結(jié)果顯示，它們的內(nèi)化存在濃度依賴效應(yīng)，隨融合蛋白濃度的增加而增加；在時(shí)間上也存在一定的依賴關(guān)系，起始隨時(shí)間的延長而增加，至3h達(dá)高峰，隨后又逐漸下降。 在驗(yàn)證了靶向細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)募?xì)胞穿透肽融合蛋白具有高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，并獲得其蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)動力學(xué)方面的一些數(shù)據(jù)后，我們再次使用點(diǎn)突變PCR技術(shù)將編碼12個(gè)氨基酸的36個(gè)寡核苷酸組成的隨機(jī)序列引入構(gòu)建好的蛋白表達(dá)載體中，構(gòu)建了可編碼12個(gè)氨基酸的隨機(jī)多肽表達(dá)文庫，并初步估計(jì)隨機(jī)肽庫的庫容

10、約為1×106。然后從平板上隨機(jī)挑取14個(gè)單克隆進(jìn)行了快速菌液PCR鑒定，通過對PCR結(jié)果的分析，判斷隨機(jī)多肽插入的情況。進(jìn)一步從菌液PCR鑒定為陽性的單克隆中抽取若干個(gè)，進(jìn)行DNA測序分析，對隨機(jī)肽序列組成的基本框架和多樣性進(jìn)行了評價(jià)。結(jié)果表明，隨機(jī)序列插入成功，其組成框架與預(yù)先引物設(shè)計(jì)NNK(N=A+G+C+T，K=G+T)模式基本相符，涵蓋了多樣的氨基酸排列形式。 通過以上實(shí)驗(yàn)我們得出如下結(jié)論： 1.本研究中基于細(xì)

11、胞穿透肽技術(shù)，利用核定位信號的功能，將兩者的作用相結(jié)合，成功構(gòu)建了可以靶向細(xì)胞核進(jìn)行運(yùn)輸?shù)牡鞍妆磉_(dá)載體。為運(yùn)輸外源蛋白、多肽及藥物進(jìn)入細(xì)胞提供了一種經(jīng)濟(jì)、有效的工具。 2.本研究表明，細(xì)胞穿透肽的位置對融合蛋白的原核表達(dá)會有一定影響，在氨基末端時(shí)，融合蛋白主要以不溶性的包涵體形式存在，而在羧基末端時(shí)有高水平的可溶性表達(dá)，這提示我們，在實(shí)際中應(yīng)用細(xì)胞穿透肽進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸時(shí)，一定要盡可能詳細(xì)的考慮其在融合蛋白中的位置，才能更好的發(fā)揮它

12、們的功能。 3.細(xì)胞穿透肽的位置對融合蛋白內(nèi)化后的入核過程沒有明顯影響，引起細(xì)胞穿透肽入核不完全的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 4.成功構(gòu)建了可以編碼12個(gè)氨基酸的隨機(jī)多肽表達(dá)文庫，在庫容和多樣性方面均可以滿足篩選的要求，為下一步進(jìn)行抗炎多肽的篩選奠定了基礎(chǔ)。 綜上所述，本研究從“組學(xué)”的角度出發(fā)，注重真核細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性、網(wǎng)絡(luò)性等特點(diǎn)，基于炎癥中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物篩選的思路，利用分子、細(xì)胞水平藥物高通量