CS-Qdots-PS介導(dǎo)的肝癌靶向基因-光動力學(xué)聯(lián)合治療的研究.pdf

1、本研究中，以原發(fā)性肝癌為治療目標(biāo)，以殼聚糖修飾的量子點(diǎn)(CS-Qdots)為基因載體和光動力學(xué)治療的介質(zhì)，設(shè)計(jì)了靶向肝癌的基因治療聯(lián)合光動力學(xué)治療的體系，并能同時(shí)實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的特異性生物發(fā)光成像。
　　第一部分 CS-Qdots的制備、表征和生物相容性分析
　　目的:研究殼聚糖(chitosan，CS)修飾的CdTe量子點(diǎn)的制備，表征和生物相容性，為其進(jìn)一步治療和成像的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:以水相直接合成法制備水溶

2、性CdTe（碲化鎘）量子點(diǎn)，其表面修飾殼聚糖成為CS-Qdots納米顆粒。運(yùn)用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)、高分辨透射電子顯微鏡(high resolution electron microscopy，HREM)、ZETA電位分析儀、熒光分光光度計(jì)(fluorescence spectrophotometer)、X射線衍射分析(x-ray diffraction，XRD)和傅

3、里葉轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析(Fourier Transform infraredspectroscopy，F(xiàn)TIR)等技術(shù)對CdTe和CS-Qdots進(jìn)行特性研究;采用細(xì)胞MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)試驗(yàn)檢測CS-Qdots體外生物相容性;采用體外溶血試驗(yàn)測定CS-Qdots的血液相容性;以治療濃度將CS-Qdots注射入小鼠尾靜脈后觀察CS-Qdots在小鼠體內(nèi)的分布情況，對小鼠進(jìn)行肝腎功能分析，血細(xì)

4、胞分析，以及主要臟器的病理學(xué)分析。
　　結(jié)果:制備的CdTe量子點(diǎn)平均粒徑大約5nm，最大發(fā)射波長為630nm，表面電荷為-16.31±0.10 mV。CdTe表面修飾殼聚糖以后，形成分散性良好，粒徑在20-30nm左右的顆粒，表面帶正電荷（28.02±0.74 mV）。經(jīng)傅里葉轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析，在FTIR圖譜上顯示出殼聚糖的特征峰。體內(nèi)外的生物相容性試驗(yàn)顯示，相比較CdTe量子點(diǎn)，CS-Qdots具有較好的生物相容性，細(xì)胞毒性

5、評價(jià)為1級，且符合醫(yī)用材料的溶血試驗(yàn)要求。經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)72小時(shí)以后主要聚集在肝臟，在腎臟有少量分布，極少在肺、心臟和脾臟聚集。以治療濃度（400μg/ml）注入尾靜脈后72小時(shí)，動物血清未見明顯的肝腎功能異常，未見明顯的血細(xì)胞計(jì)數(shù)異常，裸鼠主要臟器（肝、腎、肺、心、脾）的病理切片上也未見明顯的炎癥、壞死等異常改變。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了粒徑20-30nm，最大發(fā)射波長為630nm的CS-Qdots。經(jīng)驗(yàn)證其具有相對較好的

6、生物相容性，為其進(jìn)一步體內(nèi)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
　　第二部分 肝癌靶向自殺基因p[HRE]AFP-HSVTK和報(bào)告基因p[HRE]AFP-luc的構(gòu)建
　　目的:在轉(zhuǎn)錄水平對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)自殺基因和報(bào)告基因在肝癌細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)。
　　方法:通過堿基合成法直接合成甲胎蛋白(AFP，alpha-fetoprotein)啟動子的核心區(qū)域(0.3kb)作為下游基因在肝癌細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)的啟動子，將來源于血管內(nèi)皮細(xì)胞生

7、長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）基因的乏氧反應(yīng)序列(hypoxia responsive element，HRE)作為增強(qiáng)子與AFP啟動子的5'端融合，得到雜合啟動子[HRE]AFP，將其插入載體pCDNA3.1，替換CMV啟動子，下游插入自殺基因HSVTK，得到在肝癌內(nèi)特異性表達(dá)的治療基因重組載體p[HRE]AFP-HSVTK。用蟲熒光素酶基因luciferase替換HSVTK

8、片段，得到肝癌報(bào)告基因重組載體p[HRE]AFP-luc。分別用基因測序和限制性內(nèi)切酶酶切片段電泳方法的檢測構(gòu)建的質(zhì)粒是否正確。
　　結(jié)果:構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切片段電泳證明插入片段都在正確位置，片段大小正確。測序顯示，AFP啟動子，HRE增強(qiáng)子，自殺基因HSVTK堿基序列與GeneBank內(nèi)相應(yīng)序列比對完全吻合。
　　結(jié)論:治療基因p[HRE]AFP-HSVTK和報(bào)告基因p[HRE]AFP-luc構(gòu)建成功。
　　

9、第三部分 CS-Qdots攜帶治療基因和報(bào)告基因在肝癌細(xì)胞內(nèi)的特異性表達(dá)、靶向殺傷效果及活體成像研究
　　目的:檢測CS-Qdots的轉(zhuǎn)染效率，以其為載體將治療基因和報(bào)告基因轉(zhuǎn)染至不同細(xì)胞系的細(xì)胞和荷瘤小鼠，檢測治療基因和報(bào)告基因是否具有肝癌細(xì)胞表達(dá)的特異性，并進(jìn)行靶向殺傷效果及活體成像研究。
　　方法:通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測體系，定量檢測在不同細(xì)胞系內(nèi)[HRE]AFP啟動子的轉(zhuǎn)錄效率。以p[HRE]AFP-EGFP為報(bào)

10、告基因，檢測CS-Qdots的基因轉(zhuǎn)染能力。然后以CS-Qdots為載體通過尾靜脈注射對肝癌細(xì)胞荷瘤小鼠轉(zhuǎn)染報(bào)告基因p[HRE]AFP-luc，轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，用小動物活體成像系統(tǒng)檢測小鼠體內(nèi)的生物發(fā)光信號。再用CS-Qdots將p[HRE]AFP-HSVTK轉(zhuǎn)染至將肝癌細(xì)胞和非肝癌細(xì)胞內(nèi)，于乏氧前后檢測加入GCV后細(xì)胞的增殖率，以檢測自殺基因?qū)Ω伟┑陌邢驓芰Α?br>　　結(jié)果:CS-Qdots具有穩(wěn)定的細(xì)胞轉(zhuǎn)染能力，并且可以在體內(nèi)

11、外對基因的運(yùn)載進(jìn)行示蹤。報(bào)告基因p[HRE]AFP-luc轉(zhuǎn)染至甲胎蛋白表達(dá)陽性的肝癌細(xì)胞HepG2、陰性的肝癌細(xì)胞SMMC7721，成纖維細(xì)胞L929和結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO后的雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示，乏氧誘導(dǎo)下蟲熒光素酶的相對表達(dá)值在HepG2細(xì)胞內(nèi)增加了2.8倍，在SMMC7721細(xì)胞內(nèi)增加了5.2倍，而在L929和LOVO細(xì)胞內(nèi)乏氧誘導(dǎo)前后幾乎不能檢測到蟲熒光素酶基因的表達(dá)。p[HRE]AFP-luc報(bào)告基因被CS-Qd

12、ots運(yùn)送進(jìn)入裸鼠體內(nèi)后，通過小動物活體成像系統(tǒng)能在腫瘤部位檢測到明顯的生物發(fā)光信號。CS-Qdots/p[HRE]AFP-HSVTK轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞(HepG2和SMMC7721)與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比顯示出對GCV的敏感性(p＜0.001)，且乏氧誘導(dǎo)后敏感性提高(p＜0.001)。而轉(zhuǎn)染的非肝癌細(xì)胞，無論乏氧誘導(dǎo)與否，與未處理細(xì)胞相比都缺乏對GCV的治療敏感性(p＞0.05)。
　　結(jié)論:CS-Qdots可以作為一種穩(wěn)定的可示蹤的

13、基因載體用于體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染。[HRE]AFP雜合啟動子介導(dǎo)的下游基因具有在肝癌細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)并可被乏氧誘導(dǎo)增強(qiáng)的特性，其介導(dǎo)的HSV-TK/GCV治療體系僅對肝癌細(xì)胞敏感，介導(dǎo)的luc報(bào)告基因表達(dá)還可用于肝癌的早期診斷和成像。
　　第四部分 CS-Qdots/PS介導(dǎo)的肝癌靶向基因治療聯(lián)合FUEL-FRET光動力學(xué)治療
　　目的:通過體內(nèi)外試驗(yàn)證明CS-Qdots能通過“非結(jié)合的生物發(fā)光激發(fā)熒光”的方式（fluoresce

14、nce by unbound excitation from luminescence，F(xiàn)UEL）被激發(fā)，并能將能量通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方式（fluorescent resonce energy transfer，F(xiàn)RET）轉(zhuǎn)移給光敏劑，引發(fā)光動力學(xué)治療效應(yīng)。并檢測體內(nèi)外基因治療聯(lián)合FUEL-FRET光動力學(xué)治療對肝癌的殺傷作用。
　　方法:通過細(xì)胞外直接激發(fā)、體內(nèi)外生物發(fā)光光譜檢測的方法，證明CS-Qdots可以被細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的

15、生物發(fā)光直接激發(fā)。將光敏劑卟吩姆鈉與CdTe量子點(diǎn)共同包裹于殼聚糖中構(gòu)成CS-Qdots/PS納米粒，以其作為載體，轉(zhuǎn)染p[HRE]AFP-luc至HepG2細(xì)胞后，檢測細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧簇，還原型谷胱甘肽(GSH)，總GSH，氧化型谷胱甘肽(GSSG)以及還原型GSH與GSSG的比例，從而檢測細(xì)胞在氧化壓力下對還原型GSH的消耗;檢測細(xì)胞內(nèi)Caspase3的活性;并用MTT試驗(yàn)檢測細(xì)胞的增值率。對肝癌細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)外基因治療、FUEL-

16、FRET光動力學(xué)治療以及二者的聯(lián)合治療，通過細(xì)胞增殖率、瘤體在體生長速度、瘤體質(zhì)量等指標(biāo)檢測各組治療方法的抑瘤效果，并檢測裸鼠的肝腎功能、血細(xì)胞分析、主要臟器的病理改變來分析治療方法對裸鼠主要臟器和生理功能的影響。
　　結(jié)果:試驗(yàn)結(jié)果證明CS-Qdots可以通過FUEL的方式被生物發(fā)光信號直接激活，檢測到的生物發(fā)光信號的最大發(fā)射波長從560nm躍遷到630nm。用含有光敏劑的CS-Qdots/PS將p[HRE]AFP-luc基因轉(zhuǎn)

17、染至肝癌細(xì)胞后，在避光條件下加入底物后，相比較未處理細(xì)胞陰性對照組，檢測到細(xì)胞中了產(chǎn)生的大量活性氧簇(ROS)，還原型GSH被消耗，GSSG含量上升，細(xì)胞caspase3活性上升。體內(nèi)外的抑瘤試驗(yàn)中，與單獨(dú)治療組相比較，基因治療聯(lián)合FUEL-FRET光動力學(xué)治療組取得最明顯的抑瘤效果，腫瘤生長速度顯著下降。通過對體內(nèi)試驗(yàn)中FUEL-FRET光動力治療組的瘤體細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，光動力學(xué)治療組的細(xì)胞產(chǎn)生大量空泡，線粒體受損嚴(yán)重，各