生命早期炎癥對驚厥易感性及相關(guān)腦損傷的影響.pdf

1、研究背景
　　癲癇(epilepsy)是一種大腦神經(jīng)元發(fā)作性異常放電引起的，以反復(fù)癇樣發(fā)作(seizure)為特征的臨床癥候群，是常見的神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病。驚厥以強(qiáng)直或陣攣等骨骼肌運(yùn)動性發(fā)作為主要表現(xiàn)，常伴意識障礙。由于驚厥是癇性發(fā)作的常見形式，常常被當(dāng)做癇性發(fā)作的同義詞。兒童及成人癲癇發(fā)病率高，長期反復(fù)癇性發(fā)作會導(dǎo)致進(jìn)一步的腦損傷甚至持久性精神行為障礙，給患者本人、家庭及社會造成很大的困擾。癲癇的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，大量研究表明，癲

2、癇發(fā)病與神經(jīng)遞質(zhì)失衡、離子通道、遺傳及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞異常有著密切關(guān)系。近年來，關(guān)于癲癇的病因、發(fā)病機(jī)制及治療等的研究工作取得了很大進(jìn)展，但是癲癇發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制尚未完全闡明。
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成成分，與大腦的發(fā)育、正常生理活動、神經(jīng)病理過程、以及損傷與修復(fù)有著密切的聯(lián)系。神經(jīng)炎癥主要以膠質(zhì)細(xì)胞（特別是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞）活化、增生并分泌促炎癥細(xì)胞因子如白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子

3、α(TNFα)、白介素-6(IL-16)及抗炎細(xì)胞因子白介素-10（IL-10）等為特點(diǎn)。近年來，越來越多的研究數(shù)據(jù)表明大腦炎癥反應(yīng)參與癲癇發(fā)生及發(fā)展過程。許多研究顯示癲癇發(fā)病過程中伴有小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化增生與大量促炎癥細(xì)胞因子生成。適度的神經(jīng)炎癥是大腦應(yīng)對損傷的保護(hù)性反應(yīng)。然而，過度持續(xù)膠質(zhì)細(xì)胞活化及其產(chǎn)生的大量促炎細(xì)胞因子不僅可使血腦屏障完整性被破壞，通透性增加，促進(jìn)炎癥細(xì)胞進(jìn)一步浸潤，也可使神經(jīng)元興奮性增高，升高驚厥

4、易感性并能加劇癲癇打擊導(dǎo)致的腦損傷。因此，過度持續(xù)大腦炎癥反應(yīng)與癲癇發(fā)作互為因果，促進(jìn)癲癇的發(fā)生發(fā)展。
　　近年來，大量研究表明，生命早期炎癥不僅可導(dǎo)致急性腦損傷更可對大腦、心理及行為發(fā)育產(chǎn)生長遠(yuǎn)影響。胎兒發(fā)育關(guān)鍵時期子宮微環(huán)境的紊亂可導(dǎo)致大腦結(jié)構(gòu)、功能和發(fā)育異常，增加生后罹患神經(jīng)、精神及行為障礙的風(fēng)險。臨床上，母親孕期病毒或細(xì)菌感染均與后代孤獨(dú)癥、精神分裂癥及腦癱的發(fā)生有關(guān)。例如，前瞻性流行病學(xué)研究顯示母親孕期弓形蟲、生殖系感染

5、及感冒均可使得后代精神分裂癥發(fā)病危險性增高。此外，新生兒期炎癥刺激也可導(dǎo)致代謝、免疫及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)生長期功能性改變，增加青少年期甚至成年后神經(jīng)精神疾病及行為障礙易感性。許多動物實(shí)驗(yàn)通過制作母體免疫激活(maternalimmuneactivation，MIA)嚙齒類動物模型來測定孕期感染對后代的生理及行為效應(yīng)。在這些研究中，常通過給孕鼠注射脂多糖(LPS)或人工合成的雙鏈RNA聚肌胞苷酸(polyI∶C)，以刺激孕鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答，來

6、分別模擬母體細(xì)菌或病毒感染。LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的主要組成成分，可通過與某些細(xì)胞表面的Toll樣受體4(toll-likereceptor-4，TLR4)及TLR2結(jié)合，激活核因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)，從而誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。在MIA模型中，孕期LPS刺激可使得孕鼠血清、胎盤及羊水中促炎細(xì)胞因子mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)。大劑量LPS甚至可導(dǎo)致胎鼠大腦炎性細(xì)胞因子表達(dá)升高。另外，有研究顯示大鼠

7、孕期及新生兒期暴露于LPS可導(dǎo)致大腦海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化一直持續(xù)到成年期。由于大腦炎癥反應(yīng)可促進(jìn)癲癇發(fā)生發(fā)展，我們推測孕期及新生兒期炎癥刺激可能會增加兒童期及成年期驚厥易感性。
　　與我們的推測相符，近年來，流行病學(xué)調(diào)查資料證實(shí)母親妊娠期巨細(xì)胞病毒感染、陰道酵母菌感染、膀胱炎、持續(xù)性咳嗽大于7天及持續(xù)性腹瀉大于4天均可增加后代兒童期癲癇發(fā)病危險性。母親產(chǎn)時感染也可升高新生兒驚厥易感性。最近國外動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠新生

8、兒期炎癥刺激可增加成年期驚厥易感性。然而，孕期感染能否增加后代兒童期及成年期驚厥易感性，生命早期炎癥能否加劇癲癇打擊造成的腦損傷，能否導(dǎo)致長期腦發(fā)育及行為異常及其可能的機(jī)制，至今，未有動物實(shí)驗(yàn)報道。對上述問題的深入研究，有助于進(jìn)一步闡明癲癇及其相關(guān)腦損傷的發(fā)病機(jī)制，為其臨床防治提供新的思路。
　　第一章孕晚期免疫激活對子代青少年大鼠驚厥易感性的影響
　　研究目的:
　　研究母體孕晚期免疫激活對子代青少年大鼠驚厥易感性及

9、相關(guān)腦損傷的影響及其可能的機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.孕晚期免疫激活模型的建立
　　給予雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠在孕齡19天及20天時，連續(xù)兩天腹腔注射脂多糖(LPS)，每次300ug/kg，以構(gòu)建孕晚期免疫激活大鼠模型;對照組孕鼠腹腔注射相同容積的生理鹽水(NS)。觀察兩組孕鼠的分娩時間、產(chǎn)仔量及新生仔鼠出生體重。
　　2.子代青少年大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型的建立
　　選用生后21天(

10、postnatalday21，P21)的雄性子代青少年大鼠并隨機(jī)分組。將海人酸(kainicacid，KA)按照7.5mg/kg給予癲癇持續(xù)狀態(tài)(statusepilepticus，SE)組大鼠腹腔注射，觀察大鼠行為變化。癇性發(fā)作行為學(xué)評價根據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。具體分級標(biāo)準(zhǔn)如下:0級:正常行為狀態(tài);Ⅰ級:凝視、咀嚼、動須或頭面部輕微顫動;Ⅱ級:點(diǎn)頭、甩尾、搔抓，濕狗樣抖動;Ⅲ級:一側(cè)前肢局限性陣攣;Ⅳ級:伴后肢站立的全身強(qiáng)直性陣

11、攣發(fā)作;Ⅴ級:出現(xiàn)站立并摔倒的全身強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作。持續(xù)觀察大鼠行為，記錄發(fā)作的等級及出現(xiàn)時間。持續(xù)全身發(fā)作或連續(xù)多次全身發(fā)作之間不能恢復(fù)正常狀態(tài)超過30min者為SE(Ⅳ-Ⅴ級)。在SE開始后2小時給予水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射終止發(fā)作。僅發(fā)作達(dá)Ⅳ或Ⅴ級的大鼠納入后續(xù)試驗(yàn)。未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)的子代大鼠予以剔除。對照組青少年大鼠給予腹腔注射相同容積的NS。子代大鼠腹腔注射觀察行為變化后送回至原母鼠籠。
　　這樣，腹腔注射KA或NS

12、的青少年大鼠已經(jīng)被隨機(jī)分為4組，正常對照組(NS-NS)，生前炎癥組(LPS-NS)，海人酸致癇組(NS-KA)和“二次打擊”組(LPS-KA)。
　　3.驚厥易感性測定
　　海人酸注射后，首次癲癇發(fā)作開始時間(seizureonsettime，SOT)作為癲癇發(fā)作的潛伏期。我們將大鼠前肢局限性陣攣、后肢站立或身體失衡作為首次癇性行為。本研究中，我們用SOT來衡量青少年大鼠對海人酸的驚厥易感性。
　　4.SE后6h，隨

13、機(jī)選擇各組大鼠，采用實(shí)時定量多聚酶鏈反應(yīng)(real-timepolymerasechainreaction，RT-PCR)技術(shù)，檢測炎性因子IL-1β、TNFα、IL-6及IL-10表達(dá)情況。
　　5.SE后24h及3d時，隨機(jī)選擇各組大鼠，分別采用Westernblot方法及免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，離子鈣接頭蛋白分子1(Iba1)和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，膠原纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)變化。
　　6.

14、SE后3d，隨機(jī)選擇各組大鼠，采用NeuN免疫組織化學(xué)染色、尼氏染色和FJB染色觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及損傷情況。
　　7.在P70時，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，測定各組大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力。
　　8.Morris水迷宮測試后，采用曠場試驗(yàn)測定各組大鼠自發(fā)活動水平及探索能力。
　　結(jié)果:
　　1.孕期脂多糖刺激對孕鼠分娩時間、產(chǎn)仔量及子代鼠體重的影響。
　　暴露于LPS組孕鼠與NS注射組孕鼠在分娩時

15、間及產(chǎn)仔量上無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。LPS暴露組新生鼠平均出生體重較NS注射組顯著減低。此外，LPS暴露組子代鼠P9體重也較NS注射組子代鼠顯著減低。LPS刺激組及NS注射組子代鼠P21體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.孕期暴露于LPS導(dǎo)致子代鼠青少年期KA所致驚厥易感性增加。
　　腹腔注射KA后，LPS暴露組子代鼠(LPS-KA)SOT較NS注射組子代鼠(NS-KA)SOT縮短，表明孕期LPS刺激可導(dǎo)致子代鼠青少年期KA所致驚厥易感性

16、增加。
　　3.KA誘導(dǎo)P21大鼠SE后6小時，各組大鼠海馬炎癥因子的表達(dá)情況。
　　RT-PCR定量分析結(jié)果顯示:
　　(1)生前炎癥組(LPS-NS)IL-1βmRNA、TNFαmRNA、IL-6mRNA及IL-10mRNA的表達(dá)與正常對照組(NS-NS)無顯著差異;
　　(2)KA致癇組(NS-KA)IL-1βmRNA、TNFαmRNA、IL-6mRNA及IL-10mRNA的表達(dá)較正常對照組(NS-NS)均

17、增高;
　　(3)與NS-KA組相比，LPS-KA組IL-1βmRNA及IL-6mRNA表達(dá)增高;然而，IL-10mRNA與TNFαmRNA的表達(dá)在LPS-KA組與NS-KA組間無差異。
　　4.KA誘導(dǎo)P21大鼠SE后，各組大鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況
　　Westernblot與免疫組化染色均顯示，與NS-NS組相比，LPS-NS組、NS-KA組大鼠海馬Iba1蛋白表達(dá)水平升高;與NS-KA組相比，LPS-KA組大鼠

18、海馬Iba1蛋白表達(dá)水平升高。Iba1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示:生前炎癥刺激不但可導(dǎo)致生后海馬小膠質(zhì)細(xì)胞長期活化，并能加劇KA所致海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度。
　　5.KA誘導(dǎo)P21大鼠SE后，各組大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化情況
　　Westernblot與免疫組化染色均顯示，與NS-NS組相比，LPS-NS組、NS-KA組大鼠海馬GFAP蛋白表達(dá)水平升高;與NS-KA組相比，LPS-KA組大鼠海馬GFAP蛋白表達(dá)水平升高。GFAP蛋白表

19、達(dá)結(jié)果顯示:生前炎癥刺激不但可導(dǎo)致生后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞長期活化，并能加劇KA所致海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞活化程度。
　　6.KA誘導(dǎo)P21大鼠SE后3天，各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷情況
　　尼氏染色顯示NS-NS組大鼠海馬CA1區(qū)無神經(jīng)元損傷，形態(tài)正常。LPS-NS組、NS-KA組及LPS-KA組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)元損傷，表現(xiàn)為尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)減少，形態(tài)異常。與NS-KA組相比，LPS-KA組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷加重。尼氏染

20、色結(jié)果表明生前炎癥刺激可產(chǎn)生長期效應(yīng):生前炎癥刺激不但可導(dǎo)致生后海馬神經(jīng)元損傷，并能加劇KA所致海馬神經(jīng)元損傷。
　　NeuN與FJB染色結(jié)果同尼氏染色結(jié)果相似。
　　7.P70時，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶情況
　　在Morris水迷宮尋找隱藏平臺的學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練進(jìn)展，各組大鼠逃避潛伏期逐漸縮短。與NS-NS組相比，LPS-NS組及NS-KA組大鼠尋找到平臺的潛伏期明顯增長。與NS-KA組

21、相比，LPS-KA組大鼠尋找到平臺的潛伏期明顯增長。
　　在Morris水迷宮探索試驗(yàn)中，與NS-NS組相比，LPS-NS組與NS-KA組大鼠目標(biāo)象限活動時間百分比明顯縮短。與NS-KA組相比，LPS-KA組大鼠目標(biāo)象限活動時間百分比明顯縮短。
　　8.曠場實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠自發(fā)活動水平及探索能力表現(xiàn)情況
　　曠場實(shí)驗(yàn)自發(fā)活動結(jié)果顯示，各組大鼠水平穿越方格數(shù)及豎直站立次數(shù)無明顯不同。
　　探索行為結(jié)果顯示，LPS-

22、NS組大鼠與NS-NS組大鼠間點(diǎn)頭次數(shù)無明顯差別。與NS-NS組大鼠相比，NS-KA組大鼠點(diǎn)頭次數(shù)減少。LPS-KA組大鼠比NS-KA組大鼠點(diǎn)頭次數(shù)減少，表明LPS-KA組大鼠比NS-KA組大鼠探索能力降低。
　　結(jié)論:
　　1.孕期炎癥刺激可導(dǎo)致子代鼠青少年期海人酸所致驚厥易感性增加;
　　2.孕期炎癥刺激可增加驚厥所致青少年子代鼠海馬神經(jīng)元損傷、惡化神經(jīng)炎癥應(yīng)答并能加劇驚厥所致空間學(xué)習(xí)記憶能力及探索能力損害;

23、>　　3.孕期炎癥刺激可導(dǎo)致青少年子代鼠海馬神經(jīng)元損傷、小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞長期活化，但對海馬區(qū)炎癥因子表達(dá)無影響;
　　4.孕期炎癥刺激可導(dǎo)致子代鼠成年期空間學(xué)習(xí)及記憶能力損害;
　　綜上所述，生前炎癥刺激可能通過啟動小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞長期活化以致驚厥所致腦損傷加劇。
　　第二章孕期感染增加氯化鋰-匹羅卡品所致子代成年大鼠驚厥易感性
　　研究目的:
　　研究孕期感染對氯化鋰-匹羅卡品所致子代成年

24、大鼠驚厥易感性及相關(guān)腦損傷的影響。
　　研究方法:
　　1.孕期免疫激活模型的建立
　　雌性wistar大鼠在孕齡15及16天時，連續(xù)兩天腹腔注射脂多糖(LPS)，每次200ug/kg，構(gòu)建孕期免疫激活大鼠模型;對照組孕鼠腹腔注射相同容積的生理鹽水(NS)。
　　2.子代年輕成年大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型(SE)的建立
　　選用生后45天(postnatalday45，P45)的雄性子代年輕成年大鼠并隨機(jī)分組。腹

25、腔注射氯化鋰(LiCl，127mg/kg)后，將匹羅卡品(pilocarpine，Pilo)按照36mg/kg給予SE組大鼠腹腔注射，觀察大鼠行為變化。癇性發(fā)作行為學(xué)評價根據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行（具體分級標(biāo)準(zhǔn)見本研究第一章摘要部分）。持續(xù)觀察大鼠行為，記錄發(fā)作的等級及出現(xiàn)時間。在SE開始后1小時給予水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射終止發(fā)作。僅發(fā)作達(dá)Ⅳ或Ⅴ級的大鼠納入后續(xù)試驗(yàn)。未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)的子代大鼠予以剔除。對照組成年大鼠腹腔注射相同

26、容積的NS。
　　這樣，腹腔注射Pilo或NS的子代成年大鼠已經(jīng)被隨機(jī)分為4組，正常對照組(NS-NS)，生前炎癥組(LPS-NS)，氯化鋰-匹羅卡品(LiPC)致癇組(NS-LiPC)和“二次打擊”組(LPS-LiPC)。
　　3.驚厥易感性測定
　　LiPC注射后，首次癇性行為發(fā)作的潛伏期作為癇性發(fā)作開始時間(seizureonsettime，SOT)。我們將大鼠前肢局限性陣攣、后肢站立或身體失衡作為首次癇性行為。

27、本研究中，我們用SOT來衡量年輕成年大鼠對LiPC的驚厥易感性。
　　4.SE后3天，隨機(jī)選擇各組大鼠，采用尼氏染色觀察大鼠海馬CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及損傷情況。
　　5.P61時，采用曠場試驗(yàn)測定各組大鼠自發(fā)活動水平及探索能力。
　　6.P68時，采用高架迷宮實(shí)驗(yàn)測定各組大鼠焦慮水平。
　　7.P75時，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，測定各組大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶能力。
　　結(jié)果:
　　1.孕期暴露于

28、LPS導(dǎo)致子代鼠成年期LiPC所致驚厥易感性增加。
　　腹腔注射LiPC后，LPS暴露組子代鼠(LPS-LiPC)SOT較NS注射組子代鼠(NS-LiPC)SOT縮短，表明孕期LPS刺激可導(dǎo)致子代鼠成年期LiPC所致驚厥易感性增加。
　　2.LiPC誘導(dǎo)P45大鼠SE后3天，各組大鼠海馬CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元損傷情況。
　　尼氏染色顯示NS-NS組大鼠海馬CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)正常，無損傷。LPS-NS組、NS-L

29、iPC組及LPS-LiPC組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)元損傷，表現(xiàn)為CA1及CA3區(qū)尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)減少，形態(tài)異常。與NS-LiPC組相比，LPS-LiPC組大鼠海馬CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元損傷加重。尼氏染色結(jié)果表明生前炎癥刺激可產(chǎn)生長期效應(yīng):生前炎癥刺激不但可導(dǎo)致生后成年期大腦海馬神經(jīng)元損傷，并能加劇驚厥所致海馬神經(jīng)元損傷。
　　3.曠場實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠自發(fā)活動水平及探索能力表現(xiàn)情況。
　　曠場實(shí)驗(yàn)自發(fā)活動結(jié)果顯示，各組大鼠間水平穿越

30、方格數(shù)及豎直站立次數(shù)無明顯不同。
　　探索行為結(jié)果顯示，LPS-NS組與NS-NS組之間及NS-LiPC組與NS-NS組之間點(diǎn)頭次數(shù)均無明顯差別。LPS-LiPC組比NS-LiPC組點(diǎn)頭次數(shù)減少，表明LPS-LiPC組大鼠比NS-LiPC組大鼠探索能力降低。
　　4.各組大鼠在高架迷宮實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)情況。
　　高架迷宮實(shí)驗(yàn)中，用焦慮分?jǐn)?shù)來反映焦慮程度。結(jié)果顯示，LPS-NS組焦慮分?jǐn)?shù)低于NS-NS正常對照組，表明生前炎癥

31、刺激導(dǎo)致大鼠生后成年期焦慮水平升高。此外，NS-LiPC組焦慮分?jǐn)?shù)高于NS-NS組。LPS-LiPC組與NS-LiPC組大鼠間焦慮分?jǐn)?shù)無明顯差異。
　　5.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠空間學(xué)習(xí)及記憶情況。
　　在Morris水迷宮尋找隱藏平臺的學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練進(jìn)展，各組實(shí)驗(yàn)動物逃避潛伏期逐漸縮短。與NS-NS組相比，LPS-NS組、NS-LiPC組及LPS-LiPC組大鼠尋找到平臺的潛伏期明顯延長。與NS-LiPC

32、組相比，LPS-LiPC組大鼠尋找到平臺的潛伏期明顯延長。
　　此外，在Morris水迷宮探索試驗(yàn)中，與NS-NS組相比，LPS-NS組、NS-LiPC組及LPS-LiPC組大鼠目標(biāo)象限活動時間百分比明顯縮短。NS-LiPC組與LPS-LiPC組目標(biāo)象限活動時間百分比無明顯不同。
　　結(jié)論:
　　1.孕期炎癥刺激可導(dǎo)致子代鼠成年期LiPC所致驚厥易感性增高;
　　2.孕期炎癥刺激可增加驚厥所致成年子代鼠海馬神經(jīng)元

33、損傷;
　　3.孕期炎癥刺激可加劇驚厥所致空間學(xué)習(xí)及探索能力損害。
　　4.孕期炎癥刺激可升高子代鼠成年期焦慮水平并導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)及記憶能力損害;
　　綜上所述，生前炎癥刺激可增加生后成年期驚厥易感性并加劇驚厥所致腦損傷。
　　第三章新生兒期炎癥增加驚厥所致成年大鼠海馬依賴性記憶損傷
　　研究目的:
　　研究新生兒期免疫應(yīng)激能否導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生長期改變并探索這種變化對成年期癲癇發(fā)作所致神經(jīng)行為結(jié)果的影

34、響。
　　研究方法:
　　1.新生兒期免疫激活模型的建立
　　給予雄性SD大鼠在生后第3天(postnatalday3，P3)及P5，腹腔注射脂多糖(LPS)，每次50ug/kg，構(gòu)建新生兒期免疫激活大鼠模型;對照組新生鼠腹腔注射相同容積的生理鹽水(NS)。
　　2.免疫熒光法測定新生兒期LPS刺激對海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的影響
　　分別在P5注射LPS或NS后4天(P9)、16天(P21)及40天(P45)時處

35、死大鼠，取海馬組織。運(yùn)用離子鈣接頭蛋白分子1（Iba1，小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物）免疫熒光染色研究LPS刺激所致小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的時程變化。
　　3.在P3注射LPS或NS后，連續(xù)6天給予新生鼠腹腔注射米諾環(huán)素(minocycline)或磷酸鹽緩沖溶液(PBS)。新生鼠分為3組:SS組（正常對照組），LS組（新生兒期LPS刺激并PBS處理組）和LM組（新生兒期LPS刺激并米諾環(huán)素處理組）。分別在P9及P21時處死大鼠，運(yùn)用Iba1免疫熒光染

36、色研究米諾環(huán)素對LPS所致小膠質(zhì)細(xì)胞變化的抑制效應(yīng)。
　　4.以下設(shè)計以研究新生兒期LPS暴露能否對成年期海人酸（KA）所致神經(jīng)行為結(jié)果產(chǎn)生影響，并探究米諾環(huán)素在其中的作用。新生兒期注射NS或LPS的大鼠PBS或米諾環(huán)素處理后，在P45時腹腔注射KA，以誘導(dǎo)癲癇發(fā)作。此研究共分4組:正常對照組(SSS)，成年致癇組(SSK)，“二次打擊”組(LSK)，及“二次打擊”米諾環(huán)素治療組(LMK)。具體方法如下:
　　(1)子代年輕

37、成年大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)模型的建立
　　P45時，將KA按照15mg/kg給予SE組大鼠腹腔注射，觀察大鼠行為變化。癇性發(fā)作行為學(xué)評價根據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，具體分級標(biāo)準(zhǔn)見第一部分。本研究中，我們?nèi)杂冒B性發(fā)作開始時間(seizureonsettime，SOT)來衡量年輕成年大鼠對KA所致癲癇發(fā)作易感性。在SE開始后2小時給予大鼠水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射終止發(fā)作;
　　(2)SE后6h，隨機(jī)選擇各組大鼠，

38、采用實(shí)時定量多聚酶鏈反應(yīng)(Real-timepolymerasechainreaction，RT-PCR)技術(shù)，檢測炎性因子IL-1β及TNFα表達(dá)情況;
　　(3)SE后3天，隨機(jī)選擇各組大鼠，采用Iba1染色觀察海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況;
　　(4)從P46至P55，隨機(jī)選擇各組大鼠，運(yùn)用Y-迷宮實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠海馬依賴性空間學(xué)習(xí)情況;
　　(5)Y-迷宮實(shí)驗(yàn)后，從P60至P65，運(yùn)用水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠海馬依賴

39、性空間學(xué)習(xí)及記憶情況;
　　(6)水迷宮實(shí)驗(yàn)后，在P70，隨機(jī)選擇各組大鼠，運(yùn)用抑制回避實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠海馬依賴性非空間記憶情況。
　　結(jié)果
　　1.新生兒期暴露于LPS對成年期KA所致驚厥易感性無影響。
　　腹腔注射KA后，SSK、LSK及LMK大鼠間SOT無統(tǒng)計學(xué)差異，表明新生兒期LPS刺激對成年期KA所致驚厥易感性無影響。
　　2.新生兒期LPS免疫應(yīng)激導(dǎo)致海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生較長時間活化。
　

40、　Iba1免疫熒光染色顯示，新生兒期LPS暴露組大鼠在P9及P21，海馬區(qū)Iba1陽性染色光密度(OD)值高于新生兒期NS注射組大鼠;但是在P45時，兩組大鼠Iba1陽性染色OD值無差異。該結(jié)果顯示，新生兒期LPS免疫應(yīng)激導(dǎo)致海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生較長時間活化至青少年時期。
　　3.米諾環(huán)素抑制LPS所致小膠質(zhì)細(xì)胞活化。
　　Iba1免疫熒光染色顯示，在P9及P21，LS組海馬區(qū)Iba1陽性染色OD值高于LM與SS組;在P9及

41、P21，SS組與LM組Iba1陽性染色OD值無差異。
　　4.SE后6h，各組大鼠炎性因子IL-1βmRNA及TNFαmRNA表達(dá)情況。
　　RT-PCR定量分析結(jié)果顯示:
　　(1)SSK、LSK及LMK組IL-1βmRNA較SSS組升高;LSK組IL-1βmRNA表達(dá)較SSK組及LMK組升高;SSK與LMK間，IL-1βmRNA表達(dá)水平無差異;
　　(2)SSK、LSK及LMK組TNFαmRNA較SSS組升高

42、;LSK組TNFαmRNA表達(dá)較SSK及LMK組升高;SSK與LMK間，TNFαmRNA表達(dá)水平無差異。
　　5.SE后3天，各組大鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況。
　　Iba1免疫熒光染色顯示:SSK、LSK及LMK組Iba1陽性染色OD值較SSS組升高;LSK組Iba1陽性染色OD值較SSK及LMK組升高;SSK與LMK間，Iba1蛋白表達(dá)水平無差異;
　　6.從P46至P55，各組大鼠Y-迷宮實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)情況。
　

43、　Y-迷宮實(shí)驗(yàn)中，自發(fā)交替反應(yīng)率越高表示大鼠學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)。結(jié)果顯示SSK、LSK及LMK組自發(fā)交替反應(yīng)率低于SSS組;LSK組自發(fā)交替反應(yīng)率較SSK及LMK組降低，SSK與LMK間自發(fā)交替反應(yīng)率無差別。
　　7.從P60至P65，各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)情況。
　　結(jié)果顯示:在Morris水迷宮尋找隱藏平臺的學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)中，各組實(shí)驗(yàn)動物間學(xué)習(xí)能力無明顯差異。
　　在探索試驗(yàn)中，SSK、LSK及LMK組目標(biāo)象限活動時間百分比低

44、于SSS組，LSK組目標(biāo)象限活動時間百分比較SSK及LMK組降低，SSK與LMK間目標(biāo)象限活動時間百分比無差別。
　　8.P70時，各組大鼠抑制回避實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)情況。
　　抑制回避實(shí)驗(yàn)中，暗室逃避潛伏期越長反映大鼠海馬依賴性非空間記憶力越好。結(jié)果顯示:訓(xùn)練后1小時，LSK組暗室逃避潛伏期較SSS組明顯縮短;SSS、LMK及SSK組之間，暗室逃避潛伏期無明顯差異。訓(xùn)練后24小時，LSK組暗室逃避潛伏期較SSS、SSK及LMK組明顯