雙歧桿菌的完整肽聚糖激活巨噬細(xì)胞的信號(hào)機(jī)制.pdf

1、　　目的：雙歧桿菌的完整肽聚糖(Whole Peptidoglycan,WPG)是雙歧桿菌發(fā)揮抗腫瘤、抗感染以及免疫賦活等多種生理功能的主要成分,它能激活機(jī)體免疫系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞,使其分泌多量的細(xì)胞毒性效應(yīng)分子。目前對(duì)WPG激活巨噬細(xì)胞機(jī)制的認(rèn)識(shí)還很膚淺。我們通過(guò)觀察雙歧雙歧桿菌的WPG對(duì)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞PKC→NF-κB通路、PKC→ERK1/2→AP-1通路及其對(duì)細(xì)胞因子TNF-α mRNA表達(dá)的影響,探討雙歧桿菌的WPG激活巨噬細(xì)

2、胞的信號(hào)機(jī)制。
　　方法：分離培養(yǎng)SD大鼠腹腔巨噬細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、WPG刺激組和預(yù)孵組。(1)采用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB的核移位情況；(2)運(yùn)用凝膠電泳遷移率檢測(cè)技術(shù)(electrophoretic mobility shfit assay,EMSA)分析巨噬細(xì)胞NF-κB和AP-1的DNA結(jié)合活性的變化；(3)運(yùn)用免疫蛋白質(zhì)印跡(western blot)測(cè)定巨噬細(xì)胞磷酸化ERK1/2和IκBα的蛋白

3、表達(dá)水平；(4)采用半定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：(1)正常大鼠腹腔巨噬細(xì)胞NF-κB位于胞漿內(nèi)；WPG刺激巨噬細(xì)胞后,NF-κB被明顯激活,移位進(jìn)入胞核,應(yīng)用EMSA檢測(cè)到巨噬細(xì)胞NF-κB的DNA結(jié)合活性顯著高于對(duì)照組(P<；0.01)；應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察到WPG刺激組巨噬細(xì)胞胞核NF-κB的陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組(P<；0.01)；同時(shí)We

4、stern blot檢測(cè)到胞質(zhì)中IκBα的蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<；0.01)；但經(jīng)PKC抑制劑Chelerythrine預(yù)孵巨噬細(xì)胞后,其NF-κB的移位和DNA結(jié)合活性及IκBα的降解較WPG刺激組明顯減少(P<；0.01)。(2)未受WPG刺激的正常大鼠腹腔巨噬細(xì)胞ERK1/2處于低活性狀態(tài),給予WPG刺激巨噬細(xì)胞,其磷酸化ERK1/2的蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<；0.01),但經(jīng)PKC抑制劑Cheleryt

5、hrine預(yù)孵巨噬細(xì)胞后,其磷酸化ERK1/2的蛋白表達(dá)水平明顯低于WPG刺激組(P<；0.01)。(3)正常大鼠腹腔巨噬細(xì)胞AP-1位于胞漿內(nèi)；WPG刺激巨噬細(xì)胞后,AP-1被明顯激活,應(yīng)用EMSA檢測(cè)到巨噬細(xì)胞AP-1的DNA結(jié)合活性較對(duì)照組顯著增高(P<；0.01)；經(jīng)ERK抑制劑PD98059預(yù)孵巨噬細(xì)胞后,其AP-1的DNA結(jié)合活性較WPG刺激組顯著降低(P<；0.01)。(4)TNF-α mRNA在正常靜息大鼠腹