糖尿病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2的表達(dá)及對肽聚糖反應(yīng)性的研究.pdf

1、目的：肺臟作為糖尿病損害的靶器官本世紀(jì)70年代以來才逐漸被大家關(guān)注，廣泛涉及肺功能、生化代謝、肺組織病理等諸多方面，其中肺局部防御功能降低所致下呼吸道感染最為常見。Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種同源于果蠅Toll的蛋白分子，在對抗細(xì)菌的先天免疫過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，并且與糖尿病密切相關(guān)，現(xiàn)已日益受到關(guān)注。TLRs能夠?qū)Σ≡w識別、結(jié)合，引發(fā)一系列信號間的轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)各種炎性介質(zhì)的釋

2、放。在這個(gè)大家族中TLR2和TLR4最為受關(guān)注，TLR2能識別許多病原菌相關(guān)分子模式，包括革蘭氏陽性球菌的肽聚糖，此次實(shí)驗(yàn)我們研究了肽聚糖刺激下TLR2在正常大鼠及糖尿病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)，希望能進(jìn)一步了解糖尿病病人肺部免疫機(jī)能變化的機(jī)制，以期為感染和糖尿病的關(guān)系提供進(jìn)一步的證據(jù)，并為糖尿病感染的治療和控制提供新的作用點(diǎn)。 方法：選用健康雄性Wistar大鼠32只，SPF級，鼠齡12周，體重(200±20)克。采用Univer

3、sal32R離心機(jī)、血糖儀、鏈脲佐菌素(STZ)、肽聚糖(PGN staphylococcus aureus)、兔抗鼠TLR2。1.動物模型制備及分組：將32支雄性健康Wistar大鼠，體重約200克左右，隨機(jī)分為4組：正常對照組(A組，n=8)，糖尿病組(B組，n=8)，正常+PGN組(C組，n=8)，糖尿病+PGN組(D組，n=8)。糖尿病組一次性腹腔注射鏈脲佐菌素60mg/kg體重，正常對照組注射同等劑量枸櫞酸—枸櫞酸鈉緩沖溶液，

4、72小時(shí)后隨機(jī)血糖≥16.67mmol/L為糖尿病模型成功，以后每周復(fù)查1次血糖，連續(xù)觀察4周。2.肺泡巨噬細(xì)胞的獲取及培養(yǎng)：大鼠用水合氯醛麻醉成功后，經(jīng)氣管插管行支氣管肺泡灌洗，回收BALF，巨噬細(xì)胞培養(yǎng)，C組及D組加入終濃度為10ug/ml PGN孵育。3.免疫細(xì)胞化學(xué)染色：采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色SABC法，染色時(shí)兔抗鼠TLR2的濃度為1：200。陽性反應(yīng)為胞膜和胞漿呈棕黃色著色。4.TLR2 mRNA表達(dá)測定。5.統(tǒng)計(jì)分析：采用SP

5、SS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，各組間指標(biāo)比較用雙因素雙水平析因分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：1.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果：正常組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2表達(dá)，以胞漿及胞膜為主呈較淡的棕黃色改變；糖尿病組細(xì)胞TLR2在上述部位表達(dá)漸增多，顏色稍加深；正常+PGN組及糖尿病+PGN組細(xì)胞的胞漿及胞膜呈深棕黃色改變，部分細(xì)胞變性壞死。平均光密度值：正常組0.1146±0.002，糖尿病組0.1731±0.01

6、1，正常+PGN組0.2059±0.011，糖尿病+PGN組0.2931±0.017。2.TLR2 mRNA表達(dá)：正常組0.898±0.084，糖尿病組1.202±0.07，正常+PGN組1.628±0.11，糖尿病+PGN組2.307±0.13。糖尿病因素及肽聚糖因素導(dǎo)致肺巨噬細(xì)胞內(nèi)TLR2表達(dá)增高，P<0.001，糖尿病及肽聚糖有較明顯的主效應(yīng)以及交互作用。 結(jié)論：糖尿病可促進(jìn)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞TLR2表達(dá)，使機(jī)體處于促炎癥狀