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文檔簡介
1、結(jié)核病至今仍為嚴(yán)重的傳染病,每年的致死率仍高居傳染病殺手第二位。特別是近年來,耐多藥結(jié)核分枝桿菌和泛耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)及傳播,對臨床上現(xiàn)用抗生素的有效治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn),給人們的健康造成極大的隱患,因此我們急需尋找新型抗結(jié)核作用靶標(biāo),以篩選新型抗結(jié)核藥物。研究發(fā)現(xiàn),結(jié)核分枝桿菌基因組編碼20種細胞色素P450酶,這些P450酶在細菌體內(nèi)均發(fā)揮著著至關(guān)重要的生理功能。以CYP125A1和CYP142A1為例,因在膽固醇的降解與利用中發(fā)揮
2、重要的作用,被認(rèn)為是潛在的抗結(jié)核作用靶標(biāo)。然而,在P450酶催化體系中介導(dǎo)CYP125A1和CYP124A1電子傳遞的電子傳遞鏈蛋白至今仍未闡明。
本論文主要目的是對結(jié)核分枝桿菌細胞色素P450酶的電子傳遞鏈蛋白進行深入研究,并對參與膽固醇降解的P450酶的電子傳遞鏈進行預(yù)測及分析。我們首先采用大腸埃希菌作為宿主,克隆結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中所有P450酶的電子傳遞鏈蛋白的編碼基因從而進行外源性表達,包括鐵氧還蛋白還
3、原酶(FDR)、所有鐵氧還蛋白(FDX)和4種P450酶,并從恥垢分枝桿菌中分離出7Fe-8S鐵氧還蛋白MSFdxA;然后以2,6-二氯酚靛酚(DCPIP)或細胞色素C為電子受體評價FDR對NADH和NADPH的氧化活性以及FDR與不同F(xiàn)DX的偶聯(lián)作用;最后我們采用HPLC分析P450酶對4-膽甾烯-3-酮的代謝作用,進而研究P450酶催化體系中電子傳遞鏈蛋白與P450酶之間的關(guān)系,以期發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌中參與膽固醇降解的P450酶的電子
4、傳遞鏈蛋白。本研究成功表達了3個FDR(FdrA、FprA和FdxB的鐵氧還蛋白還原酶結(jié)構(gòu)域)、3個FDX(Fdx、FdxD和Rv1786)和4個P45O酶(CYP125A1、CYP124A1、CYP142A1和CYP143A1),從恥垢分枝桿菌中分離出MSFdxA替代FdxA、FdxC和FprBX進行研究,獲得了結(jié)核分枝桿菌P450酶電子傳遞鏈蛋白的所有類型組分;系統(tǒng)比較分析了3個FDR對NADH和NADPH的氧化活性以及這3個FDR
5、與6個FDX的偶聯(lián)情況;建立了相應(yīng)的HPLC方法分析參與膽固醇降解P450酶的電子傳遞鏈。研究表明,與FdrA偶聯(lián)作用最強的鐵氧還蛋白是FdxD和Rv1786,與FprA偶聯(lián)作用最強的是Fdx和MSFdxA,spFDX次之;FprA可以作為參與膽固醇降解P450酶的電子傳遞鏈的FDR組分,F(xiàn)drA不是參與膽固醇降解P450酶的電子傳遞鏈的FDR組分,spFDX、MSFdxA和FdxD可以作為參與膽固醇降解P450酶的電子傳遞鏈的FDX組
6、分,spFDX對CYP125A1和CYP142A1電子傳遞作用較強,MSFdxA對CYP124A1電子傳遞作用較強,F(xiàn)dx、Rv1786不是參與膽固醇降解P450酶的電子傳遞鏈的FDX組分。
因此我們推測FprA/FdxA、FprA/FdxC和(或)FprB可能是結(jié)核分枝桿菌中參與膽固醇降解P450酶的電子傳遞鏈,進一步明確了參與膽固醇降解P450酶的電子傳遞機制,并為建立以參與膽固醇降解P450酶催化體系作為藥物靶標(biāo)提供
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