結(jié)核分枝桿菌脂肪酶的功能研究.pdf

1、結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性消耗性傳染病。全世界每年新增近千萬(wàn)感染者，造成百萬(wàn)人死亡。我國(guó)是世界上結(jié)核病發(fā)病率最高的22個(gè)國(guó)家之一，結(jié)核病患病人數(shù)僅次于印度，位居第二。近年來，由于多重耐藥結(jié)核菌株、廣泛耐藥結(jié)核菌株以及HIV合并感染等問題的出現(xiàn)，使結(jié)核病的防控工作面臨更嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。
　　結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有大量的脂類成分。結(jié)核分枝桿菌基因組中有250個(gè)基因編碼假定的酶類參與了脂質(zhì)的合成或分解，表明這些酶類在

2、其生命周期或其致病中發(fā)揮著重要作用。本研究以結(jié)核分枝桿菌中Lip家族為研究對(duì)象，旨在挖掘出具有脂肪酶功能的蛋白，系統(tǒng)地分析酶的活性特征，鑒定出活性中心位點(diǎn)，分析其免疫原性，探究其在致病方面發(fā)揮的作用，從而為疫苗和新藥的研發(fā)提供有價(jià)值的新思路。
　　本研究首先克隆了結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中l(wèi)ip家族的14個(gè)基因，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，但所有表達(dá)蛋白在各種誘導(dǎo)條件下都形成了包涵體，且所有復(fù)性產(chǎn)物檢測(cè)不到脂肪酶活性。考慮到包涵體的

3、形式下蛋白已完全失去活性，而復(fù)性效果難以評(píng)價(jià)，因而換用恥垢分枝桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。在穿梭載體pMV261的基礎(chǔ)上，首先構(gòu)建了乙酰胺誘導(dǎo)型表達(dá)載體，然后將以上14個(gè)基因在恥垢分枝桿菌表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)，共有10個(gè)重組蛋白以可溶形式表達(dá)。通過對(duì)這些表達(dá)蛋白脂肪酶活性的初步篩選，發(fā)現(xiàn)LipL蛋白較其他9個(gè)蛋白對(duì)長(zhǎng)碳鏈脂肪具有更高的水解活性。LipL的底物特異性結(jié)果顯示，它不僅可以水解短碳鏈脂肪底物，對(duì)長(zhǎng)碳鏈的脂肪底物也有很高的水解活性。因此

4、，LipL屬于水解非水溶性脂肪的脂肪酶，且其酶活性的發(fā)揮不需要金屬離子的輔助。LipL脂肪酶活性的最適溫度是37 ℃，最適pH為8.0，這兩個(gè)特點(diǎn)都體現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌對(duì)其生存環(huán)境—宿主細(xì)胞微環(huán)境的適應(yīng)能力。
　　在明確 LipL蛋白的脂肪酶活性后，我們基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其與脂肪酶活性相關(guān)的基序可能為G359-X-S-X-G363、S88-X-X-K91或G49-G-G51。利用點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)對(duì)此預(yù)測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)三個(gè)基序中G50、S8

5、8和K91三個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)的突變均導(dǎo)致LipL的脂肪酶活性降低了90％。該結(jié)果表明脂肪酶的活性與S88-X-X-K91和G49-G-G51這兩個(gè)基序是相關(guān)的，其中G50、S88和K91是活性中心的關(guān)鍵氨基酸殘基。此外，我們進(jìn)一步對(duì)LipL蛋白進(jìn)行3D結(jié)構(gòu)建模，以觀察其活性相關(guān)基序及關(guān)鍵氨基酸殘基的空間位置。模擬結(jié)果顯示，LipL蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由多個(gè)α螺旋和β折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，這個(gè)結(jié)構(gòu)符合α/β水解酶家族的特征。同時(shí)，LipL蛋白的結(jié)構(gòu)

6、表面圖顯示， G49-G-G51基序在蛋白表面形成了一個(gè)pocket結(jié)構(gòu)，pocket結(jié)構(gòu)易于與底物相結(jié)合，這與G49-G-G51基序是LipL蛋白脂肪酶活性中心且G50氨基酸殘基是活性中心的關(guān)鍵氨基酸相符。利用同源建模，分析了lipL蛋白拓?fù)鋵W(xué)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步驗(yàn)證了在點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)中獲得的有關(guān)酶活性中心位點(diǎn)結(jié)果。
　　眾所周知，菌體表面蛋白不僅對(duì)病原菌的致病性至關(guān)重要，通常也是重要的免疫原。通過差速離心分離分枝桿菌的各個(gè)亞細(xì)胞組分，利

7、用Western blot技術(shù)證實(shí)了LipL蛋白定位于分枝桿菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁。該蛋白的亞細(xì)胞定位暗示其可能在分枝桿菌致病過程中起到了作用，也可能為重要的免疫原。用ELISA檢測(cè)LipL蛋白與結(jié)核陽(yáng)性血清的反應(yīng)，結(jié)果顯示結(jié)核病病人的血清中存在能與LipL蛋白發(fā)生反應(yīng)的抗體。表明LipL蛋白在結(jié)核病人感染期內(nèi)有表達(dá)，并且引起了強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答。將LipL的蛋白純化產(chǎn)物免疫BALB/c小鼠，結(jié)果表明LipL蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答

8、，并能激活CD8+介導(dǎo)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。以上結(jié)果證明LipL蛋白是分枝桿菌的一種重要免疫原。同時(shí)，將超表達(dá) LipL的恥垢分枝桿菌重組菌感染小鼠，與空載體重組菌對(duì)照組相比，Ms/LipL重組菌在小鼠肺部的定殖能力更強(qiáng)，表明LipL蛋白可能與結(jié)核分枝桿菌的致病性有一定關(guān)系。
　　綜上，本研究克隆表達(dá)了結(jié)核分枝桿菌lip家族的14個(gè)基因，構(gòu)建了分枝桿菌系統(tǒng)乙酰胺誘導(dǎo)表達(dá)載體，利用該表達(dá)系統(tǒng)鑒定出一個(gè)高活性脂肪酶LipL；詳細(xì)分析了Li