線粒體在膿毒癥淋巴細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：目前的研究發(fā)現(xiàn)大量，迅速的淋巴細(xì)胞凋亡是造成膿毒癥免疫抑制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是影響預(yù)后的重要參數(shù)。在動(dòng)物細(xì)胞中，線粒體通路是最普遍的凋亡機(jī)制和細(xì)胞凋亡核心。本實(shí)驗(yàn)采用盲腸結(jié)扎穿孔的方法復(fù)制小鼠膿毒癥動(dòng)物模型，觀察膿毒癥時(shí)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞凋亡的情況，檢測(cè)線粒體膜電位及細(xì)胞色素C在線粒體和胞漿內(nèi)含量的變化，研究線粒體在膿毒癥淋巴細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。 方法：用雌性、6～8周、C57BL/6小鼠建立盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)的膿毒癥動(dòng)物模

2、型。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組、CLP組。觀察動(dòng)物的一般情況及生存率變化。取肺臟、肝臟、脾臟、小腸行病理學(xué)檢查，確證模型；分離脾淋巴細(xì)胞，采用AnnexinV-FITC/PI標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞的凋亡變化；羅丹明123標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位的變化；分離脾淋巴細(xì)胞線粒體和胞漿組分，Western-blot檢測(cè)細(xì)胞色素C在線粒體、胞漿中的含量變化。 結(jié)果：1)膿毒癥動(dòng)物模型的確認(rèn)兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均術(shù)后很快蘇醒，對(duì)

3、照組無(wú)明顯異常反應(yīng)，且全部存活。CLP術(shù)后小鼠出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡、反應(yīng)遲鈍、活動(dòng)差、怕冷、聚居、豎毛、厭食、眼角分泌物增多等表現(xiàn)。CLP組小鼠的多臟器病理切片可見(jiàn)組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變和不同程度的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，如肺泡腔內(nèi)見(jiàn)炎性滲出物及脫落的肺泡上皮、肝細(xì)胞灶性壞死伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)、脾臟白髓淋巴濾泡內(nèi)大量呈灶性分布的淋巴細(xì)胞凋亡、小腸漿膜面出現(xiàn)大量的膿性滲出物。而對(duì)照組多臟器病理切片不見(jiàn)或少見(jiàn)異常。CLP組小鼠，24小時(shí)存活率達(dá)到80％左右，72h存

4、活率為45％～55％，符合膿毒癥動(dòng)物模型標(biāo)準(zhǔn)。2)脾淋巴細(xì)胞凋亡的檢測(cè)利用AnnexinV-FITC/PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞的凋亡變化，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組脾淋巴細(xì)胞凋亡比例為(3.52±0.25)％，CLP組脾淋巴細(xì)胞的凋亡比例增高到(17.32±2.24)％，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。證實(shí)膿毒癥模型存在明顯的淋巴細(xì)胞凋亡。3)線粒體膜電位的檢測(cè)利用陽(yáng)離子綠色熒光染料羅丹明123檢測(cè)線粒體膜電位的變化，發(fā)現(xiàn)CLP組線粒體膜

5、電位沒(méi)有降低的細(xì)胞比例下降到(76.23±1.56)％，明顯較對(duì)照組(99.62±0.37)％減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果說(shuō)明在膿毒癥模型中，淋巴細(xì)胞凋亡時(shí)線粒體功能變化，起重要作用的線粒體膜電位明顯降低。4)細(xì)胞色素C的檢測(cè)通過(guò)Western-blot檢測(cè)，從圖片可直觀地看到對(duì)照組線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C呈強(qiáng)陽(yáng)性表現(xiàn)，而CLP組線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C呈弱陽(yáng)性表現(xiàn)。對(duì)照組胞漿中的細(xì)胞色素C極少量，可視為陰性，而CLP組胞漿中的

6、細(xì)胞色素C呈強(qiáng)陽(yáng)性表現(xiàn)。經(jīng)數(shù)據(jù)分析后得出CLP組脾淋巴細(xì)胞線粒體和胞漿內(nèi)的細(xì)胞色素C含量與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。證實(shí)膿毒癥時(shí)脾淋巴細(xì)胞線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C釋放到胞漿中。 結(jié)論：1)依照文獻(xiàn)報(bào)道建立的盲腸結(jié)扎穿孔模型，經(jīng)過(guò)術(shù)后的一般情況和生存率變化，以及多臟器病理切片結(jié)果的驗(yàn)證，符合膿毒癥模型標(biāo)準(zhǔn)，可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。2)通過(guò)AnnexinV/PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示在這個(gè)CLP膿

7、毒癥模型中可測(cè)到脾淋巴細(xì)胞大量凋亡。證實(shí)了膿毒癥時(shí)存在淋巴細(xì)胞大量凋亡。淋巴細(xì)胞大量凋亡可通過(guò)造成免疫細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性或抗炎細(xì)胞因子的分泌等抑制機(jī)體免疫防御功能，從而加重膿毒癥的病情變化。3)應(yīng)用羅丹明123標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位的變化，發(fā)現(xiàn)在膿毒癥模型中脾淋巴細(xì)胞線粒體的膜電位明顯降低；Western-blot檢測(cè)到膿毒癥模型脾淋巴細(xì)胞線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C釋放到胞漿中，誘導(dǎo)凋亡。上述結(jié)果表明在膿毒癥中脾淋巴細(xì)胞線粒體功能發(fā)生明顯