膿毒癥大鼠肝細胞線粒體功能損傷機制的研究.pdf

1、目的：膿毒癥和感染性休克已成為重癥患者的主要死亡原因，肝臟是膿毒癥病程中易受累的重要器官之一。膿毒癥狀態(tài)下，肝細胞線粒體功能異常，繼之出現(xiàn)肝細胞水腫、凋亡和壞死。水通道蛋白8（AQP8）是位于線粒體內(nèi)膜的重要水通道蛋白，是調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)外水轉(zhuǎn)運的重要通道蛋白，對維持線粒體正常結(jié)構(gòu)和功能起著十分重要的作用。本文進一步探討膿毒癥狀態(tài)下大鼠肝細胞線粒體內(nèi)膜AQP8表達水平對肝細胞線粒體功能的影響。
　　方法：選用SD大鼠24只，雌雄各半，

2、隨機分為正常對照組（C組）、膿毒癥組（S組），每組12只。采用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法建立大鼠膿毒癥模型。制模18h后處死大鼠，取出部分肝臟，用比色和熒光分析法，檢測肝細胞ATP含量；再采用差速離心法提取肝細胞線粒體，用激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀法檢測線粒體膜電位水平和線粒體腫脹度；采用可見分光光度法，測定線粒體膜Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性；裂解肝細胞線粒體，分離出

3、線粒體內(nèi)膜蛋白，采用Western blot法檢測AQP8蛋白，采用實時定量熒光聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)法檢測肝組織AQP8 mRNA的表達量；從腹主動脈取血，采用酶偶聯(lián)速率法檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶線粒體同工酶（m-AST）。
　　結(jié)果：正常對照組大鼠血清ALT為(29.81±13.16) U/L、AST為(99.78±41.67) U/L和m-AST

4、為(46.23±24.24) U/L，膿毒癥組ALT為(233.02±110.16)U/L、AST為(742.56±441.41) U/L和m-AST為(412.78±252.56) U/L，與正常對照組相比，膿毒癥組轉(zhuǎn)氨酶明顯升高（P<0.01）。正常對照組大鼠肝細胞ATP含量為(94.65±17.79)nmol/mg，膿毒癥組ATP含量為(19.27±8.76) nmol/mg，比對照組明顯減少（P<0.01）。正常對照組大鼠肝線粒

5、體Na+-K+-ATP酶活性為(4.74±0.84)U/mgprot、Mg2+-ATP酶活性為(4.49±0.73)U/mgprot、Ca2+-ATP酶活性為(3.48±0.43)U/mgprot、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性為(4.68±0.81) U/mgprot，膿毒癥組Na+-K+-ATP酶活性為(2.81±0.81) U/mgprot、Mg2+-ATP酶活性為(2.59±1.03)U/mgprot、Ca2+-ATP酶活性為

6、(1.63±1.26)U/mgprot、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性為(2.54±0.97) U/mgprot，與對照組相比，膿毒癥ATP酶活性水平明顯下降（P<0.01）。正常對照組大鼠肝線粒體膜電位為(7.65±3.54)和線粒體腫脹度為(0.59±0.16)，膿毒癥組膜電位為(1.73±1.06)和線粒體腫脹度為(1.07±0.43)，線粒體膜電位水平較對照組明顯下降、腫脹度較對照組明顯增大(P<0.01)。正常對照組大鼠肝線

7、粒體內(nèi)膜AQP8蛋白表達量為(1.24±0.05)和AQP8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平設為1.00，膿毒癥組大鼠肝線粒體內(nèi)膜AQP8蛋白表達量為(0.68±0.03)和AQP8 mRNA轉(zhuǎn)錄量為(0.34±0.19)，較對照組分別下降約32.3％和65.7%，差異顯著（P<0.01)。
　　結(jié)論：
　?。?）膿毒癥組大鼠肝AQP8 mRNA轉(zhuǎn)錄量明顯減少，進而引起肝線粒體內(nèi)膜上AQP8蛋白表達水平明顯下降；
　?。?）膿毒癥大

8、鼠肝細胞內(nèi)ATP含量明顯減少；
　?。?）膿毒癥組大鼠肝線粒體膜電位水平明顯下降，腫脹度明顯增加；
　　（4）膿毒癥組大鼠肝線粒體膜各ATP酶活性均明顯下降；
　?。?）膿毒癥組大鼠肝AQP8的表達水平與肝組織ATP含量、線粒體膜電位、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性、Mg2+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性成正相關(guān)；
　　（6）膿毒癥導致肝細胞線粒體功能障礙的可能機制是，肝細胞線粒體A