膿毒癥大鼠肝細(xì)胞線粒體功能損傷機(jī)制的研究.pdf

1、目的：膿毒癥和感染性休克已成為重癥患者的主要死亡原因，肝臟是膿毒癥病程中易受累的重要器官之一。膿毒癥狀態(tài)下，肝細(xì)胞線粒體功能異常，繼之出現(xiàn)肝細(xì)胞水腫、凋亡和壞死。水通道蛋白8（AQP8）是位于線粒體內(nèi)膜的重要水通道蛋白，是調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)外水轉(zhuǎn)運(yùn)的重要通道蛋白，對(duì)維持線粒體正常結(jié)構(gòu)和功能起著十分重要的作用。本文進(jìn)一步探討膿毒癥狀態(tài)下大鼠肝細(xì)胞線粒體內(nèi)膜AQP8表達(dá)水平對(duì)肝細(xì)胞線粒體功能的影響。
　　方法：選用SD大鼠24只，雌雄各半，

2、隨機(jī)分為正常對(duì)照組（C組）、膿毒癥組（S組），每組12只。采用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法建立大鼠膿毒癥模型。制模18h后處死大鼠，取出部分肝臟，用比色和熒光分析法，檢測(cè)肝細(xì)胞ATP含量；再采用差速離心法提取肝細(xì)胞線粒體，用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀法檢測(cè)線粒體膜電位水平和線粒體腫脹度；采用可見(jiàn)分光光度法，測(cè)定線粒體膜Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性；裂解肝細(xì)胞線粒體，分離出

3、線粒體內(nèi)膜蛋白，采用Western blot法檢測(cè)AQP8蛋白，采用實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)法檢測(cè)肝組織AQP8 mRNA的表達(dá)量；從腹主動(dòng)脈取血，采用酶偶聯(lián)速率法檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶線粒體同工酶（m-AST）。
　　結(jié)果：正常對(duì)照組大鼠血清ALT為(29.81±13.16) U/L、AST為(99.78±41.67) U/L和m-AST

4、為(46.23±24.24) U/L，膿毒癥組ALT為(233.02±110.16)U/L、AST為(742.56±441.41) U/L和m-AST為(412.78±252.56) U/L，與正常對(duì)照組相比，膿毒癥組轉(zhuǎn)氨酶明顯升高（P<0.01）。正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞ATP含量為(94.65±17.79)nmol/mg，膿毒癥組ATP含量為(19.27±8.76) nmol/mg，比對(duì)照組明顯減少（P<0.01）。正常對(duì)照組大鼠肝線粒

5、體Na+-K+-ATP酶活性為(4.74±0.84)U/mgprot、Mg2+-ATP酶活性為(4.49±0.73)U/mgprot、Ca2+-ATP酶活性為(3.48±0.43)U/mgprot、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性為(4.68±0.81) U/mgprot，膿毒癥組Na+-K+-ATP酶活性為(2.81±0.81) U/mgprot、Mg2+-ATP酶活性為(2.59±1.03)U/mgprot、Ca2+-ATP酶活性為

6、(1.63±1.26)U/mgprot、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性為(2.54±0.97) U/mgprot，與對(duì)照組相比，膿毒癥ATP酶活性水平明顯下降（P<0.01）。正常對(duì)照組大鼠肝線粒體膜電位為(7.65±3.54)和線粒體腫脹度為(0.59±0.16)，膿毒癥組膜電位為(1.73±1.06)和線粒體腫脹度為(1.07±0.43)，線粒體膜電位水平較對(duì)照組明顯下降、腫脹度較對(duì)照組明顯增大(P<0.01)。正常對(duì)照組大鼠肝線

7、粒體內(nèi)膜AQP8蛋白表達(dá)量為(1.24±0.05)和AQP8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平設(shè)為1.00，膿毒癥組大鼠肝線粒體內(nèi)膜AQP8蛋白表達(dá)量為(0.68±0.03)和AQP8 mRNA轉(zhuǎn)錄量為(0.34±0.19)，較對(duì)照組分別下降約32.3％和65.7%，差異顯著（P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　（1）膿毒癥組大鼠肝AQP8 mRNA轉(zhuǎn)錄量明顯減少，進(jìn)而引起肝線粒體內(nèi)膜上AQP8蛋白表達(dá)水平明顯下降；
　?。?）膿毒癥大

8、鼠肝細(xì)胞內(nèi)ATP含量明顯減少；
　?。?）膿毒癥組大鼠肝線粒體膜電位水平明顯下降，腫脹度明顯增加；
　?。?）膿毒癥組大鼠肝線粒體膜各ATP酶活性均明顯下降；
　?。?）膿毒癥組大鼠肝AQP8的表達(dá)水平與肝組織ATP含量、線粒體膜電位、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性、Mg2+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性成正相關(guān)；
　?。?）膿毒癥導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體功能障礙的可能機(jī)制是，肝細(xì)胞線粒體A