膿毒癥過程中細(xì)胞外組蛋白對腎小管上皮細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是膿毒癥發(fā)展過程中最常見且最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。與非膿毒癥AKI不同，膿毒癥AKI最主要的致病因素是腎小管上皮細(xì)胞凋亡。有研究指出細(xì)胞外組蛋白參與了AKI的發(fā)病過程，而關(guān)于膿毒癥的研究則指出細(xì)胞外組蛋白是導(dǎo)致膿毒癥患者死亡的主要因素。因此，本研究將在前期實驗和文獻(xiàn)分析的基礎(chǔ)上探索細(xì)胞外組蛋白在膿毒癥過程中引起AKI的機(jī)制。
　　研究目的:
　　1

2、.細(xì)胞外組蛋白是否可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡;
　　2.細(xì)胞外組蛋白是否通過線粒體途徑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡。
　　研究方法:
　　體外實驗:
　　1.細(xì)胞外組蛋白對HK-2細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用
　　將50μg/ml組蛋白以等體積培養(yǎng)基作為對照（下同）與人腎小管上皮細(xì)胞（human kidney-2cell，HK-2）細(xì)胞株共培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)2h、4h和6h時用沛式細(xì)胞儀檢測HK-2細(xì)胞的凋亡率，明確細(xì)胞外組

3、蛋白的最佳培養(yǎng)時間（本實驗為4h）后換不同濃度（25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml）的組蛋白與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)，用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率并明確細(xì)胞外組蛋白作用是否存在濃度依賴性。
　　2.細(xì)胞外組蛋白通過線粒體途徑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡
　　將不同濃度的組蛋白（25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml）與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)，4h后進(jìn)行羅丹明123(Rhodamine123，Rho123)染色、提取細(xì)胞蛋白

4、，流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位變化情況;Western Blot法檢測線粒體膜蛋白Bcl-2、MAPK p38磷酸化蛋白(p-p38)、Caspase-9及Caspase-3蛋白的表達(dá)量。
　　體內(nèi)實驗:
　　將不同濃度（50mg/kg、100mg/kg）的組蛋白以等量生理鹽水作為對照，經(jīng)尾靜脈注射至BALB/c小鼠體內(nèi)，觀察6h，眼眶取血后處死，取出小鼠腎臟并去除腎蒂及包膜。部分腎組織研磨后制成細(xì)胞懸液用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋

5、亡;部分腎組織留作病理標(biāo)本，行TUNEL染色;部分腎組織用于提取蛋白，Western Blot法檢測Bcl-2、MAPK p38磷酸化蛋白的表達(dá)情況。分離小鼠血清用于檢測血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)及胱抑素C(Cys C)等腎功能指標(biāo)。
　　數(shù)據(jù)分析方法
　　采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，分析結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±S）表示。各組間均數(shù)差異顯著性的比較用單因素方差分析（one-way ANOVA）表示;

6、各組間兩兩比較用2-tailed student's t檢驗表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.體外實驗結(jié)果
　　與對照組相比，各組蛋白濃度組HK-2細(xì)胞凋亡率明顯增高，存在顯著性差異(P＜0.01);MAPKp38磷酸化蛋白、Caspase-9及Caspase-3蛋白表達(dá)量增高，Bcl-2蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)

7、計學(xué)意義(P＜0.05);各組蛋白濃度組線粒體膜電位較對照組明顯下降(P＜0.01)。
　　2.體內(nèi)實驗結(jié)果
　　與對照組相比，組蛋白100mg/kg組小鼠累計生存率明顯降低(P=0.001)，50mg/kg組小鼠生存率無顯著差異(P=0.055);各組蛋白濃度組小鼠與對照組相比，腎臟細(xì)胞凋亡率增高、MAPKp38磷酸化蛋白表達(dá)量增高、Bcl-2蛋白表達(dá)量下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);組蛋白100mg/kg組小鼠