蛋白酪氨酸磷酸酶1B對(duì)β細(xì)胞胰島素分泌功能及其胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響.pdf

1、[背景]肥胖、2型糖尿病目前已成為世界流行病。據(jù)統(tǒng)計(jì)：到2007年，全世界超重者已超過(guò)11億，其中3.12億人口為肥胖者。糖尿病也已成為危害全世界人民健康的重大問(wèn)題，到2030年，預(yù)計(jì)全世界糖尿病患病人數(shù)將從2000年的1.71億發(fā)展為3.66億。肥胖，尤其是腹型肥胖，是導(dǎo)致胰島素抵抗(Insulin resistance)的重要因素。而2型糖尿病的主要病理生理特征亦為胰島素抵抗。存在胰島素抵抗的人群較一般人群發(fā)生糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)增高5倍，

2、心血管風(fēng)險(xiǎn)增高2倍。因此，如何減輕肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗，成為預(yù)防和治療糖尿病、減少心血管風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵問(wèn)題。 目前對(duì)胰島素抵抗的研究主要集中在對(duì)傳統(tǒng)意義上的胰島素敏感組織如脂肪、肌肉、肝臟、下丘腦等的研究。初步認(rèn)為：增加運(yùn)動(dòng)、生活方式改善可增加脂肪消耗、提高肌肉對(duì)葡萄糖的利用，改善外周組織胰島素抵抗。但人們發(fā)現(xiàn)：β細(xì)胞存在胰島素抵抗，它表現(xiàn)為β細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙，導(dǎo)致β細(xì)胞分泌胰島素減少。β細(xì)胞胰島素抵抗這一概念的提出對(duì)胰島素抵

3、抗的概念做了更進(jìn)一步的補(bǔ)充，β細(xì)胞成為又一胰島素敏感組織，而重新被人們認(rèn)識(shí)。因此，對(duì)胰島β細(xì)胞胰島素抵抗的研究是治療肥胖和2型糖尿病的又一有益補(bǔ)充。 既往文獻(xiàn)報(bào)道：β細(xì)胞胰島素受體基因條件性敲除(conditional knockout)(βIRKO)小鼠可出現(xiàn)與人2型糖尿病初期相似的臨床特征：即葡萄糖刺激的胰島素第一相分泌(GSIS)喪失85％以上，βIRKO于2月齡出現(xiàn)糖耐量受損，并且糖耐量進(jìn)行性惡化。這說(shuō)明p細(xì)胞的胰島素一

4、相分泌需要胰島素受體的存在，胰島素信號(hào)通路障礙使β細(xì)胞對(duì)胰島素也發(fā)生了抵抗，表現(xiàn)為β細(xì)胞分泌異常。因此，人們首次認(rèn)識(shí)到胰島β細(xì)胞胰島素抵抗。這種β細(xì)胞胰島素抵抗可誘導(dǎo)糖耐量異常和2型糖尿病的發(fā)生。然而，對(duì)于β細(xì)胞胰島素抵抗的研究，尚處于起步階段，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道甚少。 在分子水平，胰島素的信號(hào)是以胰島素受體(insulin receptor，IR)的激活導(dǎo)致自身磷酸化開(kāi)始，然后激活的受體引起幾個(gè)底物的酪氨酸磷酸化，包括胰島素受體底物

5、1和2(insulin receptor substrate-1 and2，IRS-1，IRS-2)等。IRS-1和IRS-2酪氨酸磷酸化后，會(huì)激活磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol3 kinase，P13-K)，激活的PI3-K引起蛋白激酶B(PKB/Akt)絲氨酸磷酸化，從而刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟、肌肉和脂肪等組織，在肝臟和肌肉組織中刺激糖原合成，在脂肪組織中促進(jìn)脂肪合成。目前認(rèn)為：胰島細(xì)胞上已存在胰島素

6、信號(hào)通路，但該通路在胰島細(xì)胞如何發(fā)揮作用，受哪些因素影響，機(jī)制如何尚需要進(jìn)一步研究闡明。對(duì)于傳統(tǒng)意義上的胰島素抵抗，近年來(lái)很多研究顯示：蛋白酪氨酸磷酸酶1B(Protein Tyrosine Phosphatase-1B，PTP-1B)可能在胰島素抵抗中發(fā)揮了重要的作用。它是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中一個(gè)十分關(guān)鍵的分子。通過(guò)去磷酸化信號(hào)分子，從而終止胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。PTP-1B缺失小鼠，其表型及壽命都正常，同時(shí)胰島素和瘦素的敏感性明顯增加，能夠抵

7、抗飲食誘導(dǎo)的肥胖的發(fā)生。許多研究也進(jìn)一步證實(shí)PTP-1B可以負(fù)性調(diào)節(jié)胰島素和瘦素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。但在胰島細(xì)胞胰島素抵抗中，PTP-1B是否也發(fā)揮著類(lèi)似于其他胰島素敏感組織中的作用，需要進(jìn)一步探討。 第一部分蛋白酪氨酸磷酸酶1B在高糖/高脂誘導(dǎo)β細(xì)胞胰島素抵抗中的作用 [目的]研究胰島β細(xì)胞胰島素抵抗的誘發(fā)因素及其與蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)的關(guān)系。 [方法]傳代培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胰島beta細(xì)胞MIN6細(xì)

8、胞株分為四組，①高糖組：分別加入終濃度為33.3mmol/L、40mmol/L葡萄糖，孵育24 h；②高脂組：分別加入終濃度125umol/L、250umol/L軟脂酸，孵育24h；③無(wú)水乙醇對(duì)照組：與高脂組相對(duì)應(yīng)，加入相同體積無(wú)水乙醇，孵育24h；④正常對(duì)照組：不加葡萄糖或軟脂酸或無(wú)水乙醇，其他培養(yǎng)條件相同。應(yīng)用Trizol試劑盒分別提取高糖、高脂、無(wú)水乙醇及對(duì)照組的細(xì)胞總RNA。采用realtime-PCR法檢測(cè)各組PTP-1B基因

9、表達(dá)水平。免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察胰島beta細(xì)胞PTP-1B的表達(dá)。Western-blot免疫印跡法檢測(cè)PTP-1B蛋白表達(dá)水平。每組分別加入含2.8、16.7mmol/L葡萄糖的KRB緩沖液，37℃分別孵育1h，進(jìn)行胰島素釋放試驗(yàn)；放射免疫法測(cè)定胰島素水平。 [結(jié)論]高糖、高脂均可誘導(dǎo)β細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素分泌減少，發(fā)生胰島β細(xì)胞胰島素抵抗，但二者對(duì)β細(xì)胞的分泌功能的影響略有差異，β細(xì)胞胰島素抵抗的同時(shí)，PTP-1BmRNA

10、、蛋白表達(dá)均升高。高糖、高脂等外源性因素可能通過(guò)PTP-1B表達(dá)升高，抑制胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。PTP-1B在高糖、高脂誘導(dǎo)的β細(xì)胞胰島素抵抗中發(fā)揮著重要的作用。 第二部分蛋白酪氨酸磷酸酶1B在慢性炎癥因子誘導(dǎo)β細(xì)胞胰島素抵抗中的作用 [目的]研究胰島β細(xì)胞胰島素抵抗的誘發(fā)因素及其與蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)的關(guān)系。 [方法]傳代培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胰島beta細(xì)胞MIN6細(xì)胞株分為四組，①TNF-α A組

11、：加入終濃度為1.0 ug/LTNF-α，孵育24 h；②TNF-α B組：加入終濃度10ug/L TNF-α，孵育24h；③TNF-α C組：加入終濃度20ug/L TNF-α，孵育24h；④正常對(duì)照組：不加TNF-α，其他培養(yǎng)條件相同。應(yīng)用Trizol試劑盒分別提取各組的細(xì)胞總RNA。采用RT-PCR法檢測(cè)各組PTP-1B基因表達(dá)水平。Western-blot免疫印跡法檢測(cè)PTP-1B蛋白表達(dá)水平。每組分別加入含2.8、16.7mm

12、ol/L葡萄糖的KRB緩沖液，37℃分別孵育1h，進(jìn)行胰島素釋放試驗(yàn)；放射免疫法測(cè)定胰島素水平。 [結(jié)論]TNF-α可誘導(dǎo)β細(xì)胞葡萄糖刺激的胰島素分泌減少，發(fā)生胰島β細(xì)胞胰島素抵抗，但各干預(yù)組之間并未呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性變化趨勢(shì)。TNF-α通過(guò)PTP-1B表達(dá)升高，抑制胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。PTP-1B在慢性炎癥誘導(dǎo)的β細(xì)胞胰島素抵抗中發(fā)揮著重要的作用。 第三部分過(guò)表達(dá)蛋白酪氨酸磷酸酶1B對(duì)胰島β細(xì)胞分泌功能的影響 [目的

13、]明確蛋白酪氨酸磷酸酶1B對(duì)胰島β細(xì)胞胰島素分泌功能的影響。 [方法]傳代培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞，擴(kuò)增Ad-PTP-1B腺病毒，氯化銫密度梯度離心純化病毒并測(cè)定病毒滴度；傳代培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胰島beta細(xì)胞MIN6細(xì)胞株轉(zhuǎn)染MIN6細(xì)胞株，分三組：①轉(zhuǎn)染Ad-PTP-1B胰島β細(xì)胞組；②轉(zhuǎn)染Ad-EGFP胰島β細(xì)胞組；③胰島β細(xì)胞正常對(duì)照組。應(yīng)用Trizol試劑盒分別提取各組的細(xì)胞總RNA。采用RT-PCR法檢

14、測(cè)各組PTP-1B基因表達(dá)水平。Western-blot免疫印跡法檢測(cè)PTP-1B蛋白表達(dá)水平。每組分別加入含2.8、16.7mmol/L葡萄糖的KRB緩沖液，37℃分別孵育1h，進(jìn)行胰島素釋放試驗(yàn)；放射免疫法測(cè)定胰島素水平。 [結(jié)論]PTP-1B在胰島β細(xì)胞表達(dá)升高后，可誘導(dǎo)β細(xì)胞胰島素分泌功能降低。提示：PTP-1B直接作用于胰島β細(xì)胞，引發(fā)胰島β細(xì)胞胰島素抵抗。PTP-1B在胰島β細(xì)胞胰島素抵抗中發(fā)揮著重要的作用。

15、 第四部分 PTP-1B誘導(dǎo)β細(xì)胞胰島素抵抗胰島素信號(hào)途徑變化 [目的]觀察PTP-1B誘發(fā)β細(xì)胞胰島素抵抗的可能機(jī)制及其對(duì)胰島素信號(hào)的影響。 [方法]傳代培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞，擴(kuò)增Ad-PTP-1B腺病毒，氯化銫密度梯度離心純化病毒并測(cè)定病毒滴度；傳代培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胰島beta細(xì)胞MIN6細(xì)胞株轉(zhuǎn)染MIN6細(xì)胞株，分三組：①轉(zhuǎn)染Ad-PTP-1B胰島β細(xì)胞組；②轉(zhuǎn)染Ad-EGFP胰島β細(xì)胞組；⑨胰

16、島β細(xì)胞正常對(duì)照組。應(yīng)用Trizol試劑盒分別提取各組的細(xì)胞總RNA。采用RT-PCR法檢測(cè)各組PTP-1B基因表達(dá)水平。Western-blot免疫印跡法檢測(cè)胰島素受體β亞單位(IR-β)、胰島素受體底物-1(IRS-1)蛋白表達(dá)水平，免疫沉淀法檢測(cè)IR-β、IRS-1磷酸化水平。每組分別加入含2.8、16.7mmol/L葡萄糖的KRB緩沖液，37℃分別孵育1h，進(jìn)行胰島素釋放試驗(yàn)；放射免疫法測(cè)定胰島素水平。 [結(jié)果]1．轉(zhuǎn)染

17、PTP-1B的β細(xì)胞在無(wú)胰島素刺激時(shí)，胰島素受體β亞單位表達(dá)與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異，但受到胰島素刺激后，IRβ磷酸化明顯減弱。而轉(zhuǎn)染GFP對(duì)照病毒組與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異。提示：PTP-1B表達(dá)增高，可引發(fā)IRβ去磷酸，阻礙胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)； 2．轉(zhuǎn)染PTP-1B的β細(xì)胞在無(wú)胰島素刺激時(shí)，胰島素受體底物1(IRS-1)表達(dá)較正常對(duì)照組略偏低，但差異不顯著。當(dāng)受到胰島素刺激后，IRS-1磷酸化明顯減弱。而轉(zhuǎn)染GFP對(duì)照病毒組與正常對(duì)