Junctophilin3調(diào)控胰島β細(xì)胞胰島素分泌功能研究.pdf

1、糖尿病是由于胰島β細(xì)胞胰島素分泌或作用缺陷而導(dǎo)致的慢性疾病，病程晚期往往伴有致命并發(fā)癥。其中2型糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今尚未闡明，現(xiàn)有藥物尚無法治愈糖尿病，因此深入探索胰島β細(xì)胞分化及胰島素分泌功能調(diào)控新靶點(diǎn)與相關(guān)分子機(jī)制，是2型糖尿病防治及藥物研究亟待解決的熱點(diǎn)問題之一。β細(xì)胞外葡萄糖經(jīng)線粒體代謝產(chǎn)生ATP，關(guān)閉ATP敏感性鉀(KATP)通道誘發(fā)細(xì)胞膜去極化，使胞外Ca2+經(jīng)由電壓門控Ca2+通道(voltage-gated Ca2+

2、channels，VGCC)內(nèi)流，并放大胞漿Ca2+信號(hào)，分別從KATP通道依賴以及非依賴兩條途徑促進(jìn)β細(xì)胞內(nèi)胰島素釋放，這一過程為葡萄糖刺激的胰島素分泌(Glucose stimulated insulin secretion, GSIS)。線粒體功能完備是胰島素釋放的重要前提，線粒體功能下降導(dǎo)致的GSIS不足為2型糖尿病發(fā)病特征。正常的GSIS功能需要ATP與Ca2+信號(hào)共同維持，因此本論文試圖從線粒體代謝及Ca2+信號(hào)角度出發(fā)，探

3、索GSIS過程中尚未闡明的調(diào)控靶點(diǎn)，希望為2型糖尿病發(fā)病機(jī)制研究及藥物治療提供新的思路。β細(xì)胞胰島素分泌同時(shí)也受Ca2+信號(hào)調(diào)控。細(xì)胞內(nèi)鈣庫內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ca2+通道蘭尼堿受體(Ryanodine Receptor， RyR)、三磷酸肌醇受體(Inositol1，4，5-triphosphate receptor， IP3R)、肌漿（內(nèi)質(zhì)）網(wǎng) Ca2+-ATP酶(Sarcopkasmic/Endopkasmic reticulum Ca2+-

4、ATPase，SERCA)，以及鈣庫操控性Ca2+內(nèi)流(Store-operated Ca2+ entry，SOCE)均可通過調(diào)節(jié)胞漿Ca2+濃度，參與調(diào)控β細(xì)胞胰島素分泌。Junctophilins(JPs)是一類存在于可興奮細(xì)胞中的膜結(jié)合蛋白，可連接細(xì)胞膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜形成膜連接復(fù)合物(Junction Membrane Complexes，JMCs)，加強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)外Ca2+信號(hào)交流，維持胞內(nèi)Ca2+平衡。JP家族蛋白(JP1-JP4)分

5、布具有組織特異性。JP缺失破壞JMCs結(jié)構(gòu)引起胞內(nèi)Ca2+紊亂，也可在特異分布相應(yīng)組織作為功能蛋白受微環(huán)境改變引起應(yīng)激反應(yīng)，與多種人類疾病密切相關(guān)。β細(xì)胞具有可興奮細(xì)胞的電活動(dòng)及Ca2+變特征，但迄今尚未見有關(guān)JPs在β細(xì)胞表達(dá)及功能研究的報(bào)道，亟需加緊探索并力圖闡明與2型糖尿病可能的關(guān)系。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體經(jīng)由線粒體融合蛋白(Mitofusin1，Mfn1;Mitofusin2，Mfn2)形成并置結(jié)構(gòu)，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+經(jīng)由IP3R快速

6、穿梭進(jìn)入線粒體，點(diǎn)燃三羧酸循環(huán)，加速線粒體內(nèi)ATP生成。JP敲除可引起線粒體形態(tài)及功能受損，使Mfn2表達(dá)下調(diào)，其機(jī)制不明。提示JMCs不僅是細(xì)胞膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)連接的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也可能調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體連接。
　　本研究分為兩個(gè)部分：第一部分考察了JPs在人與小鼠胰島β細(xì)胞中表達(dá)，并探索了JP對(duì)小鼠β細(xì)胞GSIS的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示JP3在小鼠與人胰島β細(xì)胞中有表達(dá)。在原代小鼠胰島中干擾Jp3后，GSIS功能受損，伴隨線粒

7、體△Ψm、ATP產(chǎn)量以及線粒體Ca2+瞬變下降，但未激活線粒體依賴的細(xì)胞凋亡通路。與此同時(shí)，干擾Jp3可選擇性抑制RyR活性，減弱咖啡因誘導(dǎo)的胞漿Ca2+瞬變，而未激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠胰島β細(xì)胞中存在細(xì)胞膜-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體超微結(jié)構(gòu)，干擾Jp3可選擇性抑制Mfn2調(diào)節(jié)因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子α(Peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator1

8、α，Pgc-1α)核轉(zhuǎn)移，同時(shí)下調(diào)Pgc-1α轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致Mfn2表達(dá)下降。由此破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體并置結(jié)構(gòu)，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+無法快速從IP3R穿梭進(jìn)入線粒體，而降低葡萄糖刺激的ATP產(chǎn)量，導(dǎo)致ATP依賴的GSIS功能受損。本研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)人胰腺組織JP3選擇性附著于RyR2，極有可能參與GSIS過程Ca2+信號(hào)放大，從而涉及GSIS的KATP通道非依賴調(diào)控環(huán)節(jié)。此外尚發(fā)現(xiàn)人胰β細(xì)胞核內(nèi)同時(shí)表達(dá)Pgc-1α與PPARβ，提示極有可經(jīng)能由C

9、a2+信號(hào)介導(dǎo)共同參與調(diào)控Mfn2，與線粒體功能及胰島素釋放密切相關(guān)。第二部分探索了線粒體代謝脂質(zhì)傳感器PPARβ激活對(duì)人類與小鼠ES細(xì)胞分化為GSIS功能完備INS+細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PPAR激活可促進(jìn)INS+細(xì)胞分化并增強(qiáng)其GSIS功能。在小鼠ES分化為INS+細(xì)胞過程中，PPARβ激活促進(jìn)Pdx-1表達(dá)，特異性增加胰島β樣細(xì)胞分化。Foxo1為Pdx-1負(fù)調(diào)節(jié)因子，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在INS+細(xì)胞分化過程中，PPARβ

10、激活經(jīng)由PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使胞漿p-Foxo1增加，而抑制Foxo1入核活化。為探索PPARβ激活調(diào)節(jié)INS+細(xì)胞分化的潛在臨床研究意義，本部分考察了PPARβ激活在人類ES細(xì)胞分化過程中的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PPARβ激活同樣增加INS+細(xì)胞的生成及GSIS功能，伴有PI3K/Akt/Foxo1/Pdx-1通路激活。
　　本研究揭示了JP3在小鼠與人胰島β細(xì)胞中有表達(dá)。在原代小鼠胰島中JP3參與調(diào)控GSIS，并維持β細(xì)胞細(xì)

11、胞膜-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體軸完整性。小鼠胰島干擾Jp3后，減弱RyR介導(dǎo)的Ca2+瞬變，抑制Pgc-1α核轉(zhuǎn)移，使下游蛋白Mfn2表達(dá)下調(diào)，破壞線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)連接結(jié)構(gòu)，降低葡萄糖刺激的ATP產(chǎn)量，導(dǎo)致ATP依賴的GSIS功能受損。抑制小鼠胰島β細(xì)胞JP3表達(dá)，并不引起線粒體依賴凋亡或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)，提示JP3下調(diào)主要影響β細(xì)胞功能。尚揭示了人胰腺組織JP3選擇性附著于RyR2,極有可能涉及GSIS的KATP通道非依賴調(diào)控環(huán)節(jié);人胰β細(xì)胞核內(nèi)同

12、時(shí)表達(dá)Pgc-1α與PPARβ，極有可能共同參與調(diào)控Mfn2與胰島素釋放密切相關(guān)。所獲結(jié)果有利于從全新的角度深入理解胰島β細(xì)胞生理功能，為2型糖尿病防治及藥物研究提供全新的切入點(diǎn)。論證了PPARβ激活可促進(jìn)人類及小鼠ES細(xì)胞分化為INS+細(xì)胞，并增強(qiáng)該INS+細(xì)胞的GSIS功能。PPARβ為脂質(zhì)傳感器，其激活促進(jìn)線粒體脂質(zhì)氧化磷酸化，經(jīng)由PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)p-Foxo1/Foxo1狀態(tài)，抑制Foxo1活性而增加Pdx-1表達(dá)，由此