重樓皂甙Ⅱ?qū)钳徯阅I炎患者外周血CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡方式及細(xì)胞因子影響的研究.pdf

1、CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)亞群之一，在健康人體中占CD4+T淋巴細(xì)胞總數(shù)的5％～10％。研究顯示，F(xiàn)oxp3是目前公認(rèn)的CD4+CD25+Treg的特異性標(biāo)志，在一定程度上可反映CD4+CD25+Treg的水平和功能活性。它參與了免疫耐受的分子機(jī)制，對(duì)正常免疫功能的維持及調(diào)控至關(guān)重要。
　　 人體內(nèi)CD4+CD25+T細(xì)胞的數(shù)量或功能的改變與自身免疫疾病密切相關(guān)。

2、有證據(jù)表明，SLE患者外周血CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞較正常人明顯減少。
　　 從生物學(xué)活性來說，CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞至少分泌兩類抑制性細(xì)胞因子：IL-10和 TGF-β。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β可誘導(dǎo)外周初始CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)Foxp3，能使初始CD4+CD25+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有調(diào)節(jié)活性的CD4+CD25+Treg，可通過抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞的增殖、分化以及抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生而發(fā)揮免疫抑制作用。IL-10具有免疫調(diào)

3、節(jié)作用，可通過直接和間接機(jī)制明顯降低抗原特異性T細(xì)胞增殖，還能有效抑制IL-12的產(chǎn)生，而IL-12是Th1細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子。此外，IL-10還町以阻止 TCR介導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞活化。
　　 CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞作為一群機(jī)體免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞，本身也存在一個(gè)被調(diào)常的過程，CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡(PCD)是對(duì)自身的調(diào)節(jié)是機(jī)體免疫應(yīng)答過程中免疫細(xì)胞自穩(wěn)調(diào)節(jié)的重要機(jī)制之一。根據(jù)形態(tài)學(xué)可以把程序性細(xì)胞死亡

4、分為自噬、凋亡、脹亡等。
　　 重樓，又稱七葉一枝花，它的主要有效成分是甾體皂甙，包括重樓皂甙Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ等。前期實(shí)驗(yàn)證明重樓能明顯降低腎組織FN mRNA水平，有利于減輕腎臟病變。文獻(xiàn)報(bào)道，重樓皂甙有增強(qiáng)小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫的作用，重樓皂甙Ⅱ是作用較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)劑。但關(guān)于重樓皂甙如何調(diào)節(jié)免疫，尤其是對(duì)腎臟病的影響，目前研究甚少。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過觀察重樓皂甙Ⅱ干預(yù)后健康人和LN患者外周血CD4+CD2

5、5+Treg的程序性細(xì)胞死亡方式的改變及其分泌的細(xì)胞因子TGF-β、IL-10水平和Foxp3表達(dá)水平的變化，探討CD4+CD25+Treg在LN發(fā)病機(jī)制中的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 目的：分離健康人和LN患者外周血CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞，予重樓皂甙Ⅱ干預(yù)，并與地塞米松對(duì)比，通過對(duì)其自噬、凋亡、脹亡這三種細(xì)胞死亡方式、其表面的Foxp3的表達(dá)和其分泌的細(xì)胞因子 TGF-β、IL-10水平變化的研究，來了解CD4+CD25+T調(diào)

6、節(jié)細(xì)胞在LN腎炎發(fā)病中的作用以及鶯樓皂甙Ⅱ治療LN的可能機(jī)制。
　　 方法：經(jīng)密度梯度法、尼龍棉柱法和免疫磁珠分離法分離健康人和LN患者外周血淋巴細(xì)胞，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測分離所得細(xì)胞純度?？疾熘貥窃磉阿虻淖畲鬅o毒濃度，并用MTT法檢測細(xì)胞活力。將分離所得CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞和CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞，分重樓皂甙Ⅱ組(小同濃度)和DXM對(duì)照組培養(yǎng)后，觀察細(xì)胞電鏡形態(tài)學(xué)，并用流式細(xì)胞儀檢測自噬、凋亡、脹亡水平和檢測Fox

7、p3的表達(dá)，用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子 TGF-β、IL-10的水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.健康人外周血T淋巴細(xì)胞純度為75.4％～98.3％，CD4+T淋巴細(xì)胞的純度為85.54～97.5％，CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞的純度為78.57～91.06％，CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞純度為75.05～85.02％。
　　 2.LN患者外周血T淋巴細(xì)胞純度為73.5％～94.1％，CD4+T淋巴細(xì)

8、胞純度為81.4～91.2％，CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞的純度為73.57～88.6％，CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞純度為72.7～80.6％。
　　 3.10μg/ml的重樓皂甙Ⅱ在72h時(shí)能促進(jìn)健康人和LN患者外周血CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬、凋亡的增加，對(duì)于脹亡則無明顯變化。通過相關(guān)性分析顯示CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的三種細(xì)胞死亡方式在重樓皂甙Ⅱ作用后，各自獨(dú)立變化，未顯示顯著相關(guān)性。
　　 4.10μ

9、g/ml的重樓皂甙Ⅱ不能誘導(dǎo)健康人和LN患者外周血CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞自噬、凋亡、脹亡的增加，三者在重樓皂甙Ⅱ作用后，各自獨(dú)立變化，未顯示顯著相關(guān)性。
　　 5.健康人和LN患者外周血CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞能夠分泌TGF-β、IL-10，予重樓皂甙Ⅱ干預(yù)后，分泌更加旺盛。健康組和LN患者組比較，無顯著性差異。CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞分泌TGF-β、IL-10的能力遠(yuǎn)低于CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞，且予重樓皂甙

10、Ⅱ干預(yù)后，分泌末見明顯增加。健康組和LN患者組比較，無顯著性差異。
　　 6.健康人和LN患者外周血CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞在重樓皂甙Ⅱ干預(yù)下凋亡率與 TGF-β、IL-10分泌及Foxp3表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　 7.重樓皂甙Ⅱ未能改變健康人和LN患者外周血CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞Foxp3表達(dá)強(qiáng)度，且TGF-β、IL-10分泌與Foxp3表達(dá)呈顯著正相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.免疫磁珠法可

11、成功分離CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞，純度>70％。
　　 2.重樓皂甙Ⅱ能促進(jìn)健康人和LN患者外周血CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬、凋亡的增加，不能促進(jìn)脹亡的增加。
　　 3.重樓皂甙Ⅱ干預(yù)后健康人和LN患者外周血CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞三種細(xì)胞死亡方式各自獨(dú)立變化，未顯示顯著相關(guān)性。
　　 4.健康人和LN患者外周血CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的TGF-β、IL-10分泌均較旺盛，且重樓皂甙Ⅱ干預(yù)后分泌