慢病毒介導的PI3K基因沉默對雌二醇作用人子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa的影響.pdf

1、子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer, EC)是一種女性生殖系統(tǒng)習見的惡性腫瘤，近些年來發(fā)病率呈上升趨勢。無孕激素拮抗的雌二醇長期刺激與之密切相關[1]，但雌二醇具體如何調(diào)節(jié)細胞增殖的作用機制尚無確切結(jié)論。
　　本課題組前期研究表明，雌二醇能夠通過PI3K/Akt信號通路促進子宮內(nèi)膜癌細胞生成VEGF、bFGF、IL-8等，從而促進子宮內(nèi)膜癌細胞的發(fā)生發(fā)展[2，3]。為進一步闡明子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機制，本研究選取PI3K

2、為靶點，利用RNA干擾技術抑制子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa中的PI3K基因，探究其對雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞的影響及其潛在作用機制。并觀察PI3K基因沉默對子宮內(nèi)膜癌細胞裸鼠移植瘤模型的影響，初步探討PI3K基因能否成為子宮內(nèi)膜癌分子治療的新靶點。
　　本文主要從以下三方面進行了論述：
　　第一部分 慢病毒shRNA載體構(gòu)建并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞株
　　目的:本課題組前期發(fā)現(xiàn)雌二醇可以

3、通過PI3K/Akt信號通路促進子宮內(nèi)膜癌細胞產(chǎn)生VEGF、bFGF、IL-8等，從而促進子宮內(nèi)膜癌細胞的發(fā)生發(fā)展，為明確PI3K/Akt信號傳導通路對雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細胞的相關影響機制，我們利用RNAi抑制子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa中的PI3K基因，并篩選穩(wěn)定表達的細胞株，為探究PI3K基因低表達對雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細胞的影響奠定基礎。
　　方法:1.設計合成4組特異性針對PI3K基因的siRNA，構(gòu)建shRNA質(zhì)粒載

4、體，感染Ishikawa細胞。
　　2.利用RT-PCR和Western blot技術檢測各組對目的基因的抑制效果，篩選出沉默效果最佳的靶點。
　　3.將選取的最佳靶點進行包裝成慢病毒shRNA載體，感染Ishikawa細胞。
　　4.將感染目的基因的細胞Ishikawa，經(jīng)流式分選獲得穩(wěn)定的細胞株，采用RT-PCR和Western blot實驗檢測對目的基因的抑制效果。
　　結(jié)果:1.RT-PCR和Wester

5、n blot篩選出最佳干擾靶點，siRNA序列為:GAGACCAATACTTGATGTGGTTGACTAA
　　2.經(jīng)測序證實，運用特異性針對PI3K基因的siRNA，成功構(gòu)建了慢病毒shRNA載體，包裝滴度為8×108TU/ml。感染Ishikawa細胞，熒光倒置顯微鏡下觀察及流式細胞儀檢測，顯示各組感染效率均在90％以上，病毒感染成功。
　　3.經(jīng)流式細胞儀分選后，RT-PCR和Western blot驗證干擾效率，獲得

6、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。
　　結(jié)論:RNA干擾技術可有效地抑制子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa中的PI3K基因的表達，為后續(xù)實驗奠定基礎。
　　第二部分 慢病毒介導的PI3K基因沉默對雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa的體外影響
　　目的:利用RNA干擾技術抑制子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa中的PI3K基因的表達，檢測PI3K基因低表達后對雌二醇作用Ishikawa細胞后相關基因、蛋白的影響，觀察對其存活能力、周期、

7、凋亡影響，探究PI3K基因低表達后對雌二醇作用子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa的影響及其潛在機制。
　　方法:1.RT-PCR和Western blot實驗檢測雌二醇作用感染前后Ishikawa細胞后VEGF、bFGF mRNA和蛋白的表達。
　　2.MTT實驗檢測感染前后細胞的生長情況，分析PI3K基因沉默前后對Ishikawa細胞生存率的影響。
　　3.細胞遷移實驗Transwell檢測感染前后細胞的體外遷移能力，分

8、析PI3K基因沉默前后對Ishikawa細胞的體外遷移能力的影響。
　　4.流式細胞儀檢測經(jīng)雌二醇處理后各組細胞周期及凋亡率的變化，分析PI3K基因沉默后對Ishikawa細胞周期及凋亡的影響。
　　結(jié)果:1.E2作用未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞后，細胞的VEGF、bFGF基因和蛋白較對照組明顯增加(P＜0.05);NC組與Ishikawa組相比較差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);PI3K組細胞VEGF、bFGF基因和蛋白的

9、表達較Ishikawa組相比明顯減少，差別有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)
　　2.MTT實驗結(jié)果顯示:E2作用未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞后，細胞的倍增時間較對照組明顯加快(P＜0.05);NC組的細胞倍增時間與Ishikawa組相比較差別無統(tǒng)計學意義(p＞0.05); PI3K組細胞的倍增時間較Ishikawa組相比明顯延長，差別有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　3.遷移實驗顯示:E2作用未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞后，穿

10、過微孔的細胞數(shù)較對照組明顯增加（P＜0.05）;PI3K組細胞穿過微孔的細胞個數(shù)比Ishikawa組明顯減少，差別有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，表明PI3K低表達可以干擾E2上調(diào)子宮內(nèi)膜癌細胞遷移的能力。
　　4.細胞凋亡結(jié)果顯示:E2作用未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞后，比對照組總凋亡率(％)下降，差別有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);NC組的細胞總凋亡率(％)與Ishikawa組差別無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);PI3K組細胞比Is

11、hikawa組中晚期凋亡增加，總凋亡率(％)增加，差別有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　5.細胞周期實驗結(jié)果顯示，E2作用于未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細胞后，比對照組的G0/G1期比率下降，差別有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);NC組與Ishikawa組相比，各期比例差別無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);PI3K組細胞與Ishikawa組相比，G0/G1期增加，S期和G2期減少，差別有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:PI3K

12、基因低表達可以干擾E2在基因、蛋白水平激活子宮內(nèi)膜癌細胞產(chǎn)生VEGF、bFGF，可以下調(diào)E2對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的促進作用和凋亡機制作用，提示PI3K基因可能成為子宮內(nèi)膜癌分子治療的潛在靶點。
　　第三部分 構(gòu)建PI3K基因低表達Ishikawa細胞裸鼠移植瘤模型
　　目的:構(gòu)建PI3K基因低表達Ishikawa細胞的裸鼠移植瘤模型，觀察PI3K基因沉默對子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤生長的影響，進一步研究PI3K/Akt信號通路與子

13、宮內(nèi)膜癌的相關性，為子宮內(nèi)膜癌的基因治療提供動物實驗依據(jù)。
　　方法:將BALB/C裸鼠隨機分為3組，每組6只。將未轉(zhuǎn)染組(Ishikawa)細胞、陰性對照組(NC)細胞及PI3K基因沉默組(PI3K-shRNA)細胞分別接種于裸鼠右側(cè)背部。觀察移植瘤成瘤情況及腫瘤生長情況，成瘤后，用游標卡尺測量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)。按照腫瘤體積計算公式:V=0.5×a×b2來計算腫瘤體積，并繪制腫瘤生長曲線。提取移植瘤組織蛋白質(zhì)，應用W

14、estern Blot檢測各組PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤模型。Ishikawa組與NC組裸鼠移植體積增長沒有明顯差別(p＞0.05);PI3K基因低表達的PI3K組移植瘤增長較Ishikawa組明顯減慢，差異具有統(tǒng)計學意義。與Ishikawa組、NC組相比，PI3K組裸鼠移植瘤瘤體重量明顯小于其它兩組(p＜0.05），而Ishikawa組與NC組瘤體重量差別無統(tǒng)計學意義(p＞0

15、.05)。實驗PI3K組移植瘤PI3K蛋白的表達量較Ishikawa組及NC組顯著降低(P＜0.05)，而Ishikawa組與NC組間無顯著差異(p＞0.05)，提示慢病毒介導的PI3K基因RNA干擾載體在體內(nèi)仍能穩(wěn)定遺傳并高效表達。PI3K組p-Akt、VEGF、bFGF蛋白的表達量比Ishikawa組和NC組均顯著降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:PI3K基因低表達抑制子宮內(nèi)膜癌裸鼠移植瘤的生長，提示PI3K基因有可能成為子宮