H9N2亞型流感病毒浙江株的分子特征及Toll樣受體介導(dǎo)的免疫損傷機制研究.pdf

1、1998年，香港地區(qū)報告首起人感染H9N2亞型禽流感病毒（簡稱H9N2病毒）病例以后，中國大陸也相繼出現(xiàn)了人感染H9N2病毒病例。有研究表明，H9N2病毒在我國禽類從業(yè)人群中的感染率高達(dá)15％左右，并引起急性呼吸道感染癥狀。當(dāng)前，H9N2病毒在我國家禽中持續(xù)傳播，并出現(xiàn)了大規(guī)?；蛑亟M，H9N2病毒已經(jīng)成為人類呼吸道感染的重要病原之一，并作為一個潛在的流感大流行候選病毒而引起了全球的重視。
　　 本研究對2011年100份來自浙

2、江省家禽糞便樣本進(jìn)行了病毒分離，對獲得的3株H9N2病毒進(jìn)行全基因序列測定和進(jìn)化分析;應(yīng)用生物信息學(xué)軟件，對網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中H9N2病毒蛋白信息，進(jìn)行了收集處理，構(gòu)建一個實用、快速和高效的，能用于H9N2病毒生物學(xué)特征分析的蛋白數(shù)據(jù)分析庫;分別在小鼠和人細(xì)胞水平上建立了感染模型，通過對Toll樣受體(TLR)、NF-κB和IL-6表達(dá)水平之間的相互關(guān)系進(jìn)行分析，初步探討H9N2病毒對人類的致病機制。
　　 首先，在2011年2月至6

3、月期間，對來源于浙江省活禽市場中健康家禽的糞便樣本進(jìn)行收集，獲得100份樣本，并集中進(jìn)行病毒分離，將獲得的3株H9N2和9株H1亞型病毒株進(jìn)行了基因擴增、序列測定和同源性分析。結(jié)果表明，浙江省家禽中存在H9N2、H1N2和H1N3病毒，均為歐亞系;H9N2病毒出現(xiàn)了對金剛烷胺類藥物耐藥的S31N突變位點。病毒進(jìn)化分析表明，出現(xiàn)了H9N2和H1N2病毒重組現(xiàn)象，提示需加強家禽中流感病毒監(jiān)測。本研究在中國范圍內(nèi)首次報道了H1N3亞型流感病毒

4、，為H1亞型流感流行病學(xué)研究提供了重要資料。
　　 應(yīng)用生物信息學(xué)軟件，對網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中所有2013株H9N2病毒的蛋白信息，進(jìn)行了全面收集和重新處理，建立了一個總共包含PB2、PB1、PB1-F2、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS2等11個流感病毒蛋白的數(shù)據(jù)分析庫，共包含了8948條序列信息。分析發(fā)現(xiàn)，禽類是H9N2病毒的主要自然宿主(占97.47％)，主要分離于1997至2012年期間(占96.32％)，主要來

5、自亞洲地區(qū)(占96.37％)。有78.10％的H9N2病毒HA蛋白234位氨基酸為亮氨酸，具有與人類細(xì)胞優(yōu)先結(jié)合的特性;有9.3％的H9N2病毒M2蛋白出現(xiàn)了對金剛烷胺類藥物耐藥的S31N突變點。該蛋白數(shù)據(jù)分析庫，能快速進(jìn)行有針對性的病毒生物特征分析，為有效預(yù)測H9N2病毒的感染性、致病性和耐藥性提供參考。
　　 為了評價H9N2病毒對哺乳動物的致病性，本研究首先在小鼠水平上建立了H9N2病毒誘導(dǎo)急性肺損傷的動物模型，對正常小鼠

6、和受病毒感染小鼠的外周血和肺臟中的IL-6、SOD、TLR4、TLR7和NF-κ3表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，H9N2病毒浙江株A/chicken/Zhejiang/329/2011(Zj329)能感染小鼠，出現(xiàn)典型的急性臨床癥狀。病毒感染小鼠后，小鼠肺組織細(xì)胞中TLR4、TLR7和NF-κB mRNA水平發(fā)生了明顯上調(diào)，并引起外周血中炎性因子IL-6大量表達(dá)，在感染后第6d，這些參數(shù)值都達(dá)到最高。外周血中SOD表達(dá)水平在病毒感染后的2

7、-6d內(nèi)發(fā)生下降，在第4d達(dá)到最低值。
　　 進(jìn)一步在人肺A549細(xì)胞水平上建立了H9N2病毒(Zj329)的細(xì)胞感染模型，對Zj329病毒感染后細(xì)胞中和細(xì)胞上清中TLR4、TLR7、NF-κ3和IL-6表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，Zj329病毒能有效感染A549細(xì)胞，出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變現(xiàn)象。病毒感染A549細(xì)胞后，細(xì)胞中TLR4和TLR7mRNA水平都發(fā)生了明顯上調(diào)，在病毒感染后12h達(dá)到最高值，同時NF-κB和IL-6表達(dá)

8、活性也發(fā)生了明顯上調(diào)，在24h內(nèi)隨時間增加而增強。
　　 綜上所述，本研究得出以下結(jié)論:
　　 1、浙江省家禽中存在H9N2病毒，均為歐亞系。
　　 2、首次發(fā)現(xiàn)H9N2和H1N2亞型流感病毒之間出現(xiàn)了重組現(xiàn)象。
　　 3、H9N2病毒浙江株能有效感染小鼠和人A549細(xì)胞，發(fā)生肺臟損傷和細(xì)胞病變，TLR4、TLR7、NF-κB和IL-6介導(dǎo)了H9N2病毒感染哺乳動物而引起的免疫損傷過程。
　　 總

9、之，在近年來禽流感病毒感染人類時有發(fā)生的情況下，本研究構(gòu)建的具有實用和快速的H9N2病毒蛋白數(shù)據(jù)分析庫，為有效分析H9N2病毒的感染性、致病性和耐藥性提供參考。通過本研究的開展，獲得了H9N2病毒浙江株的相關(guān)信息，并在中國范圍內(nèi)首次報道了H1N3亞型流感病毒，發(fā)表了相關(guān)SCI論文3篇，不僅豐富了我國流感病毒的分子流行病學(xué)資料，也將為人感染禽流感防治工作的開展提供科學(xué)依據(jù)。同時，本研究對于闡明H9N2病毒在感染人類呼吸道過程中的致病機制，