Ghrelin對(duì)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的研究.pdf

1、研究背景及目的
　　Ghrelin是1999年由日本科學(xué)家Kojima從大鼠的胃粘膜里提取出的含有28個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的小分子短肽。Ghrelin是GHSR的內(nèi)源性配體，配體包括兩種亞型即：GHS-R1a和GHS-R1b。目前的研究主要集中在ghrelin通過(guò)GHSR-1a受體介導(dǎo)產(chǎn)生生物學(xué)作用上，GHS-R1b的功能目前還不清楚。GHSR-1a受體在人體內(nèi)多個(gè)器官均有表達(dá)，包括下丘腦、腎上腺、甲狀腺、胃、腸道等，它的生理作用包括

2、包括增強(qiáng)食欲、促進(jìn)合成代謝、促進(jìn)睡眠和增強(qiáng)免疫能力等。近幾年發(fā)現(xiàn)ghrelin具有保護(hù)心血管系統(tǒng)的功能，包括抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管新生以及抑制炎癥反應(yīng)等。
　　心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞是微血管的基本結(jié)構(gòu)，參與微血管內(nèi)外物質(zhì)交換和血管新生等，具有重要生理作用。心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷常常是動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病血管并發(fā)癥和高血壓等疾病的始動(dòng)環(huán)節(jié)，并貫穿疾病發(fā)展的整個(gè)過(guò)程。因此對(duì)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用的藥物可以改善上述疾病的血

3、管功能，預(yù)防和治療心血管疾病。
　　本研究擬探討在體外培養(yǎng)條件下，不同濃度的ghrelin對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和分泌NO的影響，以及可能存在的機(jī)制，以期找到對(duì)心肌微血管內(nèi)皮損傷具有保護(hù)作用的可選新型藥物，將來(lái)應(yīng)用于臨床。
　　方法
　　第一部分：CMECs的分離培養(yǎng)和表形鑒定：通過(guò)酶消化法獲得SD大鼠的CMECs，在37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h后，采用Dil-ac-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)鑒定CMECs。

4、r>　　第二部分：不同濃度的ghrelin對(duì)大鼠CMECs增殖、遷移和分泌NO的影響：1.選擇新一代CEMCs分為4組，分別干預(yù)24小時(shí)：A空白對(duì)照組；B1×10-9mol/Lghrelin組；C1×10-8mol/Lghrelin組；D1×10-7mol/Lghrelin組;1.MTT法和PCNA蛋白免疫熒光染色檢測(cè)CMECs增殖的影響；2.transwell法檢測(cè)CMECs遷移的影響；3.硝酸還原法檢測(cè)CMECs分泌NO的量。

5、>　　第三部分：ghrelin影響大鼠CMECs增殖、遷移和分泌NO影響的機(jī)制：將CMECs分為2組：A空白對(duì)照組；B1×10-7mol/Lghrelin組；Cghrelin+拮抗劑LY294002組（1×10-7mol/Lghrelin和20mol/LLY294002）;1.MTT法檢測(cè)CMECs增殖的影響；2.transwell法檢測(cè)CMECs遷移的影響；3.硝酸還原法檢測(cè)CMECs分泌NO的量。4.westernblot檢測(cè)ghr

6、elin和LY294002作用前后CMECs中AKT和p-AKT表達(dá)的變化。
　　對(duì)空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)求其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用one-wayANOVA，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較采用Dunnet-t檢驗(yàn)，以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1．細(xì)胞培養(yǎng)第5d，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞呈單層排列，細(xì)胞為多角形，呈鋪路石樣改變；培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)Dil-ac-LDL

7、吞噬實(shí)驗(yàn)后，激光共聚焦顯微鏡觀察顯示90％以上細(xì)胞呈Dil-ac-LDL陽(yáng)性表達(dá)。
　　2．10-8-10-7mol/L的ghrelin可明顯促進(jìn)CMECs的增殖和遷移，同時(shí)它還能明顯促進(jìn)CMECs的NO分泌。
　　3．LY294002能夠明顯抑制ghrelin對(duì)CMECs的促增殖和遷移作用，同時(shí)，它也能夠抑制ghrelin刺激CMECs分泌NO的作用。
　　結(jié)論
　　一定濃度條件下，ghrelin能夠促進(jìn)心肌微