NLRP3炎癥小體信號(hào)在高糖和脂多糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞中的表達(dá)及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:糖尿病腎病是糖尿病特異性微血管并發(fā)癥之一，是西方終末期腎病的主要原因。糖尿病腎病起病隱匿，發(fā)病機(jī)制不清。目前認(rèn)為炎癥反應(yīng)是糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)。固有免疫是機(jī)體組織的第一道防線，它通過(guò)模式識(shí)別受體識(shí)別和結(jié)合病原體上的病原相關(guān)分子模式（如病毒、細(xì)菌）和自身?yè)p傷相關(guān)分子模式（如高血糖、高血脂），啟動(dòng)機(jī)體炎性反應(yīng)，應(yīng)答環(huán)境中的微生物及理化損傷，以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。NLRP3炎癥小體是固有免疫家族的重要成員，它不僅是炎性免疫反應(yīng)的

2、“感受器”，亦是炎性免疫反應(yīng)的“調(diào)節(jié)器”。NLRP3炎癥小體能夠識(shí)別外源性和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，激活Caspase-1，活化IL-1β、IL-18、IL-33等炎性因子，觸發(fā)炎癥瀑布效應(yīng)。NLRP3炎癥小體在代謝性疾病炎癥中扮演著重要角色，然后其在糖尿病腎病中的作用及機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)觀察NLRP3炎癥小體信號(hào)通路在高糖、脂多糖(LPS)以及活性氧(ROS)抑制劑NAC作用下腎系膜細(xì)胞的表達(dá)，旨在探討NLRP3炎癥小體信號(hào)在糖尿病腎病

3、炎癥激活過(guò)程中的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制，找到以NLRP3炎癥小體信號(hào)通路為靶點(diǎn)防治糖尿病腎病的理論依據(jù)和新思路。
　　方法:1、體外實(shí)驗(yàn):(1)細(xì)胞培養(yǎng)及分組:體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞，以高糖和脂多糖作為刺激因子，活性氧抑制劑NAC作為阻斷劑，分別設(shè)以下六組:①正常對(duì)照組(NC組):5.6mmol/L葡萄糖;②不同濃度高糖組（HG組）:HG1:10mmol/L葡萄糖，HG2:20mmol/L葡萄糖，HG3:30mmol/L葡萄糖;③

4、甘露醇對(duì)照組（OP組）:5.6mmol/L葡萄糖+24.4mmol/L甘露醇;④高糖+NAC組（HG+NAC組）:表達(dá)較強(qiáng)濃度的高糖+10μmol/L NAC;⑤不同濃度脂多糖組（LPS組）:LPS1:1ug/L LPS，LPS2:5ug/L LPS，LPS3:10ug/L LPS;⑥脂多糖+NAC組（LPS+NAC組）:表達(dá)較強(qiáng)濃度的脂多糖+10μmol/L NAC。(2)各組細(xì)胞分別培養(yǎng)6、12、24h后，用蛋白免疫印跡法、RT-P

5、CR檢測(cè)各組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、硫氧還結(jié)合蛋白(TXNIP)蛋白及mRNA表達(dá)。2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):(1)糖尿病模型建立及分組:雄性Wistar大鼠20只，隨機(jī)分為糖尿病模型組（10只）和正常對(duì)照組（10只），糖尿病模型組一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（60mg/kg），正常對(duì)照組給予等體積的枸櫞酸緩沖液腹腔注射。(2)分別飼養(yǎng)6周和8周，收集各組大鼠尿液檢測(cè)24h尿蛋白定量;心臟采血檢測(cè)空腹血糖;取腎臟組織行免疫組化檢測(cè)各

6、組TXNIP、IL-1β的表達(dá)。3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1、體外實(shí)驗(yàn):(1)高糖刺激腎系膜細(xì)胞NLRP3炎癥小體信號(hào)分子的表達(dá)變化:與正常組相比，不同作用濃度和時(shí)間的高糖均可上調(diào)TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL

7、-1β蛋白及mRNA表達(dá)(P＜0.05)，且呈濃度/時(shí)間依賴性，以30mmol/L葡萄糖作用24h表達(dá)最強(qiáng)。(2)脂多糖刺激腎系膜細(xì)胞NLRP3炎癥小體信號(hào)分子的表達(dá)變化:與正常組相比，不同作用濃度和時(shí)間的脂多糖均可上調(diào)TXNIP、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白及mRNA表達(dá)(P＜0.05)，也呈一定濃度/時(shí)間依賴性，以10ug/L脂多糖作用12h達(dá)峰值。(3)予NAC干預(yù)高糖及脂多糖后，腎系膜細(xì)胞NLRP3炎癥小體信號(hào)

8、分子的表達(dá)變化:與高糖組相比，預(yù)先加入NAC阻斷氧化應(yīng)激可阻止高糖誘導(dǎo)的NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TXNIP蛋白及mRNA表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05);與脂多糖組相比，預(yù)先加入NAC可阻止脂多糖誘導(dǎo)的NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TXNIP蛋白及mRNA高表達(dá)(P＜0.05)。2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):(1)大鼠一般情況指標(biāo):與正常組相比，糖尿病組體重增加明顯延緩(P＜0.05)，而空腹血糖及24h尿蛋白定量則顯著升高(