內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在高糖誘導系膜細胞表型轉(zhuǎn)化中的作用研究.pdf

1、研究背景
　　目前糖尿病腎病(DN)的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)正在急劇增加,是引起終末期腎衰竭的最常見原因,其病情進展快,治療難度大,由于其發(fā)病機理尚未完全闡明,缺乏有效防治手段,致殘致死率高,已經(jīng)成為腎臟醫(yī)學領(lǐng)域最急迫需要解決的問題。糖尿病腎病的主要病理特征是HGMCs增殖和胞外基質(zhì)(ECM)聚集。在此病理過程中,高血糖引起的HGMCs的表型轉(zhuǎn)化是一個關(guān)鍵性環(huán)節(jié),表現(xiàn)為HGMCs肥大、α-SMA的異常表達、ECM大量分泌等。大量研究

2、認為,高糖刺激細胞代謝應激反應的多效性是典型的信號網(wǎng)絡(luò)失衡,DN發(fā)病與腎小球的血流動力學改變、系膜細胞多元醇代謝途徑異常、蛋白非酶糖化和大分子糖化終末產(chǎn)物(AGEs)的生成、細胞因子的異常表達等因素密切相關(guān)。而目前的研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)很可能就是高糖所致細胞內(nèi)信號反應網(wǎng)絡(luò)失衡的總開關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細胞內(nèi)最大的細胞器之一,具有大面積的膜結(jié)構(gòu),其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)外除合成折疊的蛋白質(zhì)外,還駐留有大量的信號蛋白分子,故其發(fā)揮的功能遠遠不止既往

3、認為的蛋白質(zhì)糖基化以及輔助蛋白質(zhì)正確折疊,事實上它在將細胞質(zhì)信號與線粒體、細胞核功能偶聯(lián)方面發(fā)揮了重要作用,扮演著關(guān)鍵角色。目前,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細胞漿信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的整合器這一功能已受到高度重視。而既往研究已證實,糖尿病引起的高糖狀態(tài)可以誘導包括HGMCs在內(nèi)的多種腎臟靶細胞發(fā)生ERS。由此推測,對ERS進行調(diào)控進而對DN高糖環(huán)境誘導的HGMCs發(fā)生細胞表型轉(zhuǎn)化產(chǎn)生作用,可能影響DN腎臟損傷的進程,從而有可能為有效的治療糖尿病腎病的找到新的思

4、路。而已在多種動物模型中成功應用的4-苯基丁酸(4-PBA)是一類小分子伴侶,近期研究發(fā)現(xiàn)它可以運輸突變蛋白,從而具有穩(wěn)定蛋白構(gòu)象,改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊能力。因此,予以4-PBA進行干預來控制ERS的輕度,可能為DN的臨床治療提供新的途徑。
　　目的
　　本研究擬用高糖刺激HGMCs,動態(tài)觀察在高糖環(huán)境下,系膜細胞表型轉(zhuǎn)化情況和發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的情況,其次,通過應用分子伴侶4-PBA調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激強度觀察對系膜細胞在高糖刺激下的作用

5、,以期明確高糖誘導HGMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用并初步闡明其機制。
　　方法
　　1.將培養(yǎng)的HGMCs分為NC組、高糖組(HG組)和HG+4-PBA組。
　　2.采用CCK-8試劑盒進行細胞增殖率測定。
　　3.使用流式細胞儀進行細胞周期測定。
　　4.免疫組化方法檢測HGMCs中的α-SMA表達。
　　5.實時定量RT-PCR方法測定各組各時相點重要分子如Grp78、TGFβ1、FN

6、、NOX4、NF-kB的基因表達相對量(RQ)。
　　6.用Western-blot方法測定各組各時相點上述重要分子的蛋白表達水平變化情況。
　　結(jié)果
　　1.高糖刺激HGMCs早期即發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應,而藥物分子伴侶4-PBA可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的發(fā)生。具體而言,Grp78是重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶,其特異性的表達標志著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的發(fā)生。對照組Grp78mRNA始終處于較低的表達水平;而予以高糖刺激后Grp78mR

7、NA表達在早期(6h)即較對照組顯著上調(diào),其表達在12h達高峰,而后逐漸下降,但仍顯著高于對照組;予以藥物分子伴侶4-PBA可明顯的抑制高糖誘導的Grp78mRNA表達上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義。同時,高糖刺激后,與對照組相比Grp78蛋白表達明顯增加,而予以4-PBA干預可以明顯抑制這種增高趨勢。
　　2.高糖刺激后系膜細胞增殖明顯增快,與對照組差異有統(tǒng)計學意義;細胞增殖指數(shù)PI值也顯示明顯升高;高糖刺激同時給予小分子伴侶4-PBA

8、(5mmol/L)干預,系膜細胞增殖活性在48h受到顯著抑制,而細胞增殖指數(shù)則從24h起即受到顯著抑制,差異有統(tǒng)計學意義。
　　3.對照組系膜細胞存在低水平的α-SMA表達,高糖刺激可增加α-SMA表達。用5mmol/L4-PBA干預可以顯著抑制高糖誘導的α-SMA表達。應用IPP軟件分析熒光強度顯示,HG組顯著高于正常對照組,而應用4-PBA干預后使熒光強度較HG組降低,差異有統(tǒng)計學意義。
　　4.予以高糖刺激后TGFβ1

9、mRNA的表達較正常對照組明顯增加,在24h左右達高峰,顯著高于對照組。而予以化學分子伴侶4-PBA可明顯的抑制由高糖誘導的TGFβ1mRNA的表達上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義。同樣的,高糖刺激可誘導TGFβ1蛋白的表達明顯增加,而予以4-PBA干預后可以抑制增高趨勢。
　　5.予以高糖刺激后FNmRNA的表達明顯增加,在24h左右達高峰,顯著高于對照組。而予以化學分子伴侶4-PBA可明顯的抑制由高糖誘導的FNmRNA的表達上調(diào),差異有

10、統(tǒng)計學意義。
　　6.予以高糖刺激后Nox4mRNA的表達明顯增加,顯著高于對照組。而予以化學分子伴侶4-PBA可明顯的抑制由高糖誘導的Nox4mRNA的表達上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義。
　　7.予以高糖刺激后NF-kBmRNA的表達明顯增加,顯著高于對照組。而予以化學分子伴侶4-PBA可明顯的抑制由高糖誘導的NF-kBmRNA的表達上調(diào),差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論
　　1.高糖培養(yǎng)條件下可誘導人腎系膜細胞發(fā)生表型

11、轉(zhuǎn)化,即由靜息型向活躍型轉(zhuǎn)化,表現(xiàn)為細胞形態(tài)學發(fā)生改變,亞細胞結(jié)構(gòu)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器增生活躍;同時細胞增殖速度、增殖指數(shù)等均高于對照組;免疫細胞學研究表明高糖誘導下人腎系膜細胞大量合成表達α-SMA是細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的有力證據(jù);
　　2.在高糖誘導人腎系膜細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的過程中早期即有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的參與,而應用藥物分子伴侶4-PBA可以抑制此過程中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應;
　　3.應用分子伴侶4-PBA早期調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應可以

12、顯著對抗高糖培養(yǎng)誘導人腎系膜細胞表型轉(zhuǎn)化的作用,并抑制此過程中一些關(guān)鍵細胞因子如TGF-β1、FN等mRNA及其蛋白合成,提示調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可能通過抑制上述關(guān)鍵分子的表達完成對細胞表型轉(zhuǎn)化的抑制作用;
　　4.在此過程中,應用分子伴侶4-PBA早期調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應同樣可以顯著下調(diào)高糖培養(yǎng)誘導人腎系膜細胞表型轉(zhuǎn)化過程中氧化應激通路以及炎癥反應通路的關(guān)鍵細胞因子如Nox4、NF-kB等mRNA的表達,并同樣的抑制其蛋白合成,提示高糖

13、誘導人腎系膜細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化是多條信號通路、多種細胞因子參與的復雜信號網(wǎng)絡(luò)失衡的過程,而調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可能正是該信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的關(guān)鍵點。
　　綜上所述,高糖可誘導體外培養(yǎng)的人腎系膜細胞發(fā)生細胞表型轉(zhuǎn)化,表現(xiàn)為過度增殖并上調(diào)α-SMA、TGF-β1、FN等的表達,此過程中伴隨有ERS的發(fā)生,且抑制ERS程度可相應的抑制細胞增殖及下調(diào)HGMCs表達α-SMA、TGF-β1、FN等重要因子。同時,此過程中還有其他信號通路的參與,如Nox4