腫瘤壞死因子α對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮樣細(xì)胞和大鼠血管平滑肌細(xì)胞syndecan-4蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景 動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是導(dǎo)致臨床心腦血管疾病的重要原因之一。日益增多的證據(jù)表明，動(dòng)脈粥樣硬化是對(duì)血管損傷的過(guò)度炎癥反應(yīng)。腫瘤壞死因子α是一種主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白，TNF-α是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，可從多種不同的炎癥細(xì)胞中釋放，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。Syndecan-4是硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate，HS)類(lèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多糖synde

2、cans家族的成員之一。Syndecan-4是存在于血管床的主要蛋白聚糖之一，Syndecan-4作為一種與生長(zhǎng)因子結(jié)合的共受體(co-receptor)，調(diào)控著多種細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，在細(xì)胞伸展、細(xì)胞識(shí)別、細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖控制中扮演著重要的角色，同時(shí)也介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。因此研究syndecan-4在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所扮演的一系列潛在功能角色，從而為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的思路是相當(dāng)必要的。 目的 以體外

3、培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮樣細(xì)胞和SD大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞為對(duì)象，應(yīng)用MTS/PES、Westem blotting蛋白免疫印跡等方法觀察腫瘤壞死因子α分別對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮樣細(xì)胞和大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖及syndecan-4蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步從細(xì)胞和分子水平上闡述sylldecan-4蛋白在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用。 方法 1．細(xì)胞增殖的檢測(cè)： 實(shí)驗(yàn)一：應(yīng)用96孔板體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮樣細(xì)胞

4、的細(xì)胞株，用終濃度為1，10，20，100ng/ml的TNF-α分別作用24小時(shí)及36小時(shí)，每組濃度每個(gè)時(shí)間鋪兩列孔，共16副孔。同樣實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)6次，每組共96例實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。每次設(shè)相同例數(shù)的無(wú)TNF-α刺激的孔做為對(duì)照組進(jìn)行比較，共96例對(duì)照實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以明確應(yīng)用TNF-α刺激后的細(xì)胞是否比無(wú)刺激的細(xì)胞有變化。采用MTS/PMS法確定人臍靜脈內(nèi)皮樣細(xì)胞的增殖狀態(tài)。 實(shí)驗(yàn)二：96孔板體外培養(yǎng)SD大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，用終濃度為

5、1，10，20，100ng/ml的TNF-α作用24小時(shí)，每組濃度鋪兩列孔，共16副孔。同樣實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)6次，每組共96例實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。每次設(shè)相同例數(shù)的無(wú)TNF-α刺激的孔做為對(duì)照組進(jìn)行比較，共96例對(duì)照實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以明確應(yīng)用TNF-α刺激后的細(xì)胞是否比無(wú)刺激的細(xì)胞有變化。采用MTS/PMS法確定大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的增殖狀態(tài)。 2．Syndecan-4蛋白表達(dá)的檢測(cè)： 實(shí)驗(yàn)一：體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮樣細(xì)胞，用終濃度為1，

6、10，20，100ng/ml的TNF-α分別作用24小時(shí)及36小時(shí)，裂解細(xì)胞提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定總蛋白濃度，利用Western blotting蛋白免疫印跡法測(cè)定人臍靜脈內(nèi)皮樣細(xì)胞syndecan-4蛋白的表達(dá)情況。每組濃度每個(gè)時(shí)間重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次，共4例實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并每次設(shè)無(wú)TNF-α刺激的做為對(duì)照組，以便用于計(jì)算灰度值。 實(shí)驗(yàn)二：體外培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，分別用終濃度為1，1 0，20，100ng/ml的

7、腫瘤壞死因子α(TNF-α)作用24小時(shí)。裂解細(xì)胞提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定總蛋白濃度，利用Westem blotting蛋白免疫印跡法測(cè)定大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞syndecan-4蛋白的表達(dá)情況。每組濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次，共4例實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。并每次設(shè)無(wú)TNF-α刺激的做為對(duì)照組，以便用于計(jì)算灰度值。 結(jié)果 1、TNF-α對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮樣細(xì)胞增殖的影響在TNF-α存在24小0時(shí)的條件下，各組細(xì)胞的增殖率分別為對(duì)照組

8、1.956±0.214，TNF-αl00ng/ml組2.154±0.250，TNF-α20ng/ml組2.26±0.151，TNF-α10ng/ml組2.118±0.205，TNF-α1ng/ml組2.106±0.136。統(tǒng)計(jì)分析顯示低至1ng/ml的TNF-α仍能明顯刺激人臍靜脈內(nèi)皮樣細(xì)胞的增殖(F=29.522，P<0.001)，其中以TNF-α20ng/ml組細(xì)胞增殖最顯著(F=29.522，P<0.001)。36小時(shí)各組細(xì)胞的增

9、殖率分別為對(duì)照組1.915±0.242，TNF-α100ng/ml組2.067±0.328，TNF-α20ng/ml組2.207±0.150，TNF-α10ng/ml組2.052±0.126，TNF-α1ng/ml組2.051±0.178。統(tǒng)計(jì)分析顯示低至1ng/ml的TNF-α仍能明顯刺激人臍靜脈內(nèi)皮樣細(xì)胞的增殖(F=21.719，P<0.001)，其中仍以TNF-α20ng/ml組細(xì)胞增殖最顯著(F=21.719，P<0.001)。

10、但與24小時(shí)相比，細(xì)胞的增殖率有所減低。 2、TNF-α對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮樣細(xì)胞syndecan-4蛋白表達(dá)的影響以對(duì)照組的密度掃描結(jié)果為1，TNF-α作用人臍靜脈內(nèi)皮樣細(xì)胞24小時(shí)的syndecan-4蛋白表達(dá)結(jié)果如下，1ng/ml組2.429±0.765，lOng/ml組3.284±0.582，20ng/ml組6.780±0.658，100ng/ml組4.026±0.445，與對(duì)照組相比均有顯著性差異。其中以20ng/ml TN

11、F-α組刺激人臍靜脈內(nèi)皮樣細(xì)胞syndecan-4蛋白表達(dá)量最高，與其它劑量組相比均有顯著差異(F=36.846，P<0.001)，100ng/mlTNF-α組刺激人臍靜脈內(nèi)皮樣細(xì)胞syndecan-4蛋白表達(dá)量較1ng/ml組為高(F=36.846，P=0.004)。當(dāng)1、10、20、100 ng/ml的TNF-α作用36 h后，仍能明顯刺激人臍靜脈內(nèi)皮樣細(xì)胞syndecan-4蛋白的表達(dá)(1ng/ml組1.322±0.114，10n

12、g/ml 2.239±0.079，20ng/ml組2.573±0.066，100ng/ml組2.155±0.108)，其中以TNF-α20ng/ml組細(xì)胞增殖最顯著(F=129.214，P<0.001)。但與24 h同等劑量組相比，人臍靜脈內(nèi)皮樣細(xì)胞syndecan-4蛋白的表達(dá)量明顯減少。3、TNF-α對(duì)SD大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響在TNF-α存在24小時(shí)的條件下，各組細(xì)胞的增殖率分別為對(duì)照組1.001±0.064，TNF-α 1

13、00ng/ml組1.215±0.231，20ng/ml組1.566±0.060，10ng/ml組1.125±0.198，1ng/ml組1.082±0.272。統(tǒng)計(jì)分析提示低至1ng/ml的TNF-α仍能明顯刺激大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖(F=132.899，P=0.044)，其中以TNF-α20ng/ml組細(xì)胞增殖最顯著(F=132.899，P<0.001)。 4、TNF-α對(duì)SD大鼠血管平滑肌細(xì)胞syndecan-4蛋白表達(dá)的影

14、響以對(duì)照組的密度掃描結(jié)果為1，統(tǒng)計(jì)分析表明，1、10、20、100ng/ml的TNF-α均能明顯刺激大鼠血管平滑肌細(xì)胞syndecan-4蛋白的表達(dá)(1.24±0.126，1.639±0.345，4.937±0.598，3.708±0.37)，與對(duì)照組相比均有顯著性差異，其中以20ng/ml TNF-α組刺激血管平滑肌細(xì)胞syndecan-4蛋白表達(dá)量最高，與其它劑量組相比均有顯著差異(F=77.502，P<0.00 1)，1 00ng