基于幾種色譜分析方法的生物樣本的代謝組學研究.pdf

1、代謝組學又稱代謝物組學,是研究機體代謝產(chǎn)物譜變化的一種新的系統(tǒng)方法。作為一種“組學”科學,它借助高通量、高靈敏度與高精確度的現(xiàn)代分析技術,分析細胞、組織和其它生物樣本如血液或尿液中內(nèi)源性代謝物整體組成(Metabolome)并通過其復雜的、動態(tài)的變化來辯識和解析被研究對象的生理病理狀態(tài)。代謝物組是蛋白質組、轉錄組和基因組總體表達的結果,直接反映組織的生化狀態(tài),能夠較靈敏地刻畫生命體生理病理狀態(tài)的變化,對于闡明生命復雜系統(tǒng)具有極為重要的意

2、義。其最主要的特征就是高通量的實驗和大規(guī)模的計算,從系統(tǒng)生物學的角度出發(fā),全面地綜合地考察代謝變化。作為嶄新的方法學,代謝組學已成為國際上疾病與健康研究的一個重要熱點。因此用代謝組學的方法來研究復雜疾病包括代謝性疾病(如肥胖),對于疾病的早期診斷、預防、藥物干預具有重要的指導意義,而代謝組學研究必須要有高通量、高靈敏度與高精確度的分析技術來支撐,對獲得的樣品中所有代謝物進行分析鑒定是代謝組學研究的重要步驟,也是變化最復雜最難控制從而導致

3、分析結果難以重現(xiàn)的關鍵所在。與原有的各種組學技術只分析特定類型的物質不同,代謝組學分析對象的大小、數(shù)量、官能團、揮發(fā)性、帶電性、電遷移率、極性以及其他物理化學參數(shù)差異很大,必須要對它們進行無偏向的全面分析,采用傳統(tǒng)的分析方法依靠單一待定組分的已知性質獲取信息,有以下局限性：(Ⅰ)樣品處理方法復雜耗費人力；(Ⅱ)步驟多,方法多特異性,每種只適用于幾種組分；(Ⅲ)代謝物降解造成假相,重現(xiàn)性差；(Ⅳ)不能滿足樣品的通過速率；(Ⅴ)不能測出協(xié)同

4、效應。核磁共振(NMR)較早地被運用到代謝組學研究,但是NMR的缺點是靈敏度較低,有可能形成信號重疊,且其對樣品制備的要求很高,在發(fā)展成為高通量的分析方法時,受到局限。同時因為動態(tài)范圍有限,很難同時測定生物體系中共存的濃度相差較大的代謝產(chǎn)物。由于體液中所含組分眾多,得到的核磁譜圖往往很復雜,單獨采用NMR很難對復雜的產(chǎn)物組分進行指認,因此,需要將NMR分析手段與其他各種色譜技術進行聯(lián)用,方能成為藥物代謝物組學研究的強大的手段。同時其靈敏

5、度比MS差,所需進樣量相對較大,因此體液中的很多痕量組分往往可能檢測不到,而色譜是最常用和有效的分離分析工具,其與質譜的聯(lián)用則可以完成從成分分離到鑒定的一整套工作。因此建立適用于代謝組學研究的色譜分離分析方法具有可行性和迫切性。本文從生物樣本的前處理方法入手,確定了切實可行的樣本前處理方法,通過一系列方法學研究建立適用于代謝組學研究的GC/MS、LC/MS和pCEC分離分析技術,以尿液為研究對象,進行代謝組學分析,結合PCA,PLS-D

6、A,OPLS-DA等模式識別技術解決大量色譜峰的識別和代謝變化的趨勢分析,同時將該方法用于檢測高脂飼料誘導的肥胖大鼠自身代謝的變化,考察本論文建立方法的適用性和準確性,得到了重現(xiàn)性好、穩(wěn)定、特征性顯著的代謝組學圖譜,為進一步研究奠定了基礎。研究結果如下：1.建立了生物樣本的前處理方法。在生物樣本(本文主要是指尿液)中影響最大的是蛋白質,若用色譜法測定時,蛋白質會沉積在色譜柱上發(fā)生堵塞,嚴重影響分離效果。本文通過實驗篩選建立了尿液的前處理

7、方法。首先將尿液在14000rpm下離心沉淀蛋白、濃縮富集直接用于LC/MS的測定,離心之后所得上清液用衍生化試劑氯甲酸乙酯(ECF)衍生,直接進行GC/MS和pCEC分析。結果表明,建立的尿液前處理方法簡單、方便,適合大批量尿液的處理。2.建立了適合代謝組學研究的GC/MS測定方法。首先通過實驗確定了尿液樣品的處理方法及測試條件(包括尿液樣本的各種不同處理方法的篩選,衍生化處理過程中尿液樣本用量的選擇、衍生化試劑的選擇、前處理方法中催

8、化劑的選擇、衍生化條件的選擇、GC/MS升溫程序的優(yōu)化等),建立了用于代謝組學研究的GC/MS測定方法,方法學研究表明建立的方法重復性好、靈敏度高,精確度高,適用于快速的高通量檢測。采用建立的GC/MS方法測定不同時間點對照組與高脂飼料誘導大鼠的尿液。采用優(yōu)化的方法,檢測到了約200~250個尿樣代謝物,通過譜庫檢索和采用標準品比對確定了其中的80多個代謝物。得到的原始數(shù)據(jù)首先經(jīng)過XCMS軟件處理,利用Matlab software 7

9、.0和SIMCA-P11.0等統(tǒng)計軟件而建立的多維數(shù)據(jù)處理和計算方法,進行PCA分析,通過PCA得分圖可以清楚地區(qū)分開對照組大鼠與高脂飼料誘導大鼠的代謝物的區(qū)別,說明用代謝組學方法可以區(qū)分出兩種不同飲食動物的代謝物譜差異。采用OPLS-DA進行進一步的數(shù)據(jù)處理,由OPLS-DA分析結果可以直觀的看出尿液中內(nèi)源性代謝物含量發(fā)生的變化,尿液中代謝物的升高或降低揭示了與此相關的代謝途徑發(fā)生的變化。3.首次將pCEC技術應用到代謝組學研究中,建

10、立了適合于代謝組學研究的pCEC測定方法。通過實驗確定了尿液樣品的處理方法及測試條件(包括尿液樣本用量的選擇、衍生化試劑的選擇、前處理方法中催化劑的選擇、衍生化條件的選擇、以及pCEC測試條件如檢測波長、酸溶液種類、酸改性劑濃度、流動相組成、操作電壓、梯度洗脫條件的優(yōu)化等),建立了用于代謝組學研究的pCEC測定方法,方法學研究表明建立的方法重復性好、靈敏度高,適用于快速的高通量檢測。采用建立的pCEC方法分析了不同時間點對照組大鼠與高脂

11、飼料誘導大鼠的代謝特征。采用優(yōu)化的方法,檢測到了約100個尿樣代謝物,通過標準品比對確定了其中變化差異明顯的8個代謝物。從pCEC圖譜就可以直觀的看出對照組大鼠與喂食高脂飼料肥胖大鼠代謝物發(fā)生了顯著的變化(包括8個確定的代謝物與7個沒有定性的代謝物),得到的原始數(shù)據(jù)首先經(jīng)過XCMS軟件處理,利用Matlab software 7.0和SIMCA-P11.0等統(tǒng)計軟件而建立的多維數(shù)據(jù)處理和計算方法,進行PCA分析,通過PCA得分圖可以更清

12、楚地區(qū)分開對照組大鼠與高脂飼料誘導大鼠的代謝物的區(qū)別,說明用代謝組學方法可以區(qū)分出不同飲食條件下動物的代謝物譜差異。采用OPLS-DA進行進一步的數(shù)據(jù)處理,由OPLS-DA分析結果可以直觀的看出尿液中內(nèi)源性代謝物含量發(fā)生的變化,尿液中代謝物的升高或降低揭示了與此相關的代謝途徑發(fā)生的變化。4.建立了適合代謝組學研究的LC/MS測定方法。首先通過實驗確定了尿液樣品的處理方法及測試條件,在14000rpm下高速離心,直接進樣分析,色譜條件：色

13、譜柱：Agilent Eclipse XDB-C8 5μm,4.6mm×150mm；流速：0.8ml/min；柱溫：40℃；流動相：乙腈-0.2%HAC水溶液梯度洗脫；UV：254nm；MS：APCI+ESI混合離子化模式,72~1000范圍內(nèi)正離子全掃描模式；氣流10.0L/min；溫度：350℃；噴霧溫度：250℃；毛細管電壓：2000V,建立了用于代謝組學研究的LC/MS測定方法,方法學研究表明建立的方法重復性好、靈敏度高,適用于

14、快速的高通量檢測。同時采用建立的LC/MS方法分析了不同時間點對照組與高脂飼料誘導大鼠的代謝特征。采用優(yōu)化的方法,檢測到了約100個尿樣代謝物,通過提取離子與標準品比對確定了其中的20多個代謝物。得到的原始數(shù)據(jù)首先經(jīng)過XCMS軟件處理,利用Matlab software 7.0和SIMCA-P11.0等統(tǒng)計軟件而建立的多維數(shù)據(jù)處理和計算方法,進行PCA分析,PCA分析能夠揭示出對照組大鼠與高脂飼料誘導肥胖大鼠的總體代謝物的差異；為了找出

15、發(fā)生變化的重要的內(nèi)源性代謝物,我們采用了一種新型的監(jiān)督性算法OPLS-DA。OPLS-DA回歸系數(shù)能夠直觀的表示出尿樣中重要代謝物的升高或者降低,從而研究關鍵代謝物通道的變化。5.對三種建立的色譜分析方法在代謝組學研究中的應用進行了比較。體內(nèi)代謝產(chǎn)物多而復雜,對某一物種、某個組織或其細胞中所有的代謝途徑中的所有代謝產(chǎn)物同時進行全面的高通量的定性和定量分析,在理論上行得通。但目前沒有任何一個分析技術能夠同時對代謝組中的所有化合物進行分析。