Piwil2重編程兒童成纖維細(xì)胞形成腫瘤干細(xì)胞的初步研究.pdf

1、目的: 觀察精原干細(xì)胞自我更新基因Piwil2重編程兒童成纖維細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)及功能特征變化，建立Piwil2調(diào)控腫瘤干細(xì)胞發(fā)生過程的細(xì)胞實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　方法: 將攜帶Piwil2-GFP標(biāo)記的和空載的目的基因GFP標(biāo)記的慢病毒載體分別感染原代培養(yǎng)的小兒包皮成纖維細(xì)胞，篩選建立穩(wěn)定表達(dá)Piwil2-GFP和GFP成纖維細(xì)胞系，觀察細(xì)胞形態(tài)變化及腫瘤球形成過程。體外分析細(xì)胞染色體核型，RT-PCR鑒定重編程后細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)記物OCT-

2、4，Sox2，Nanog，c-Myc，Klf-4及三胚層分化的相關(guān)標(biāo)志物Nestin，Tubb3，Brabury, CATA-4等。裸鼠體內(nèi)成瘤實驗，組織學(xué)觀察腫瘤形態(tài)，RT-PCR，免疫組織化學(xué)進(jìn)一步分析分析干細(xì)胞及各胚層指標(biāo)在裸鼠腫瘤中的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　①熒光顯微鏡觀察到轉(zhuǎn)染Piwil2-GFP和空載GFP成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，兩組細(xì)胞均穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光。48h流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率為51.2％和45.7％，繼續(xù)篩選

3、培養(yǎng)后穩(wěn)定表達(dá)率約70％，且Piwil2-GFPFB細(xì)胞體積變小，形態(tài)逐漸由長梭型變?yōu)閳A形并出現(xiàn)集落樣生長，集落可形成圓形克隆。
　?、赗T-PCR檢測Piwil2-GFP FB細(xì)胞過表達(dá)Piwil2，表達(dá)干細(xì)胞多能基因Oct-4，Sox2，Nanog，Klf-4，c-Myc及三胚層分化相關(guān)基因。
　?、廴旧w核型結(jié)果顯示Piwil2-GFP FB細(xì)胞染色體分別為67-70條的超二倍體結(jié)構(gòu)，可見多倍體染色體。
　?、堋?/p>

4、腫瘤球”樣克隆裸鼠體內(nèi)移植2周時100％形成腫瘤，腫瘤組織學(xué)及免疫組化鑒定為來表達(dá)多種外胚層，中胚層及內(nèi)胚層腫瘤標(biāo)志物的惡性腫瘤，RT-PCR顯示細(xì)胞及裸鼠腫瘤表達(dá)干細(xì)胞多能基因Oct-4，Nanog，Sox2以及三胚層特征標(biāo)記物。
　　結(jié)論:
　?、貾iwil2基因成功轉(zhuǎn)染兒童成纖維細(xì)胞且細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，形成腫瘤球樣集落。
　?、赑iwil2重編程后的成纖維細(xì)胞具有干細(xì)胞和多潛能分化特征，致瘤性及腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性。