人包皮成纖維細(xì)胞體外誘導(dǎo)重編程為多能干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：本研究建立原代培養(yǎng)人包皮成纖維細(xì)胞（human postnatAlforeskin fibroblast hPFF）體系,絲裂霉素－C（Mitomycin C，MMC）處理hPFF制備人體組織來(lái)源細(xì)胞飼養(yǎng)層；將分別表達(dá)Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因慢病毒顆粒感染hPFF，探討目的基因過(guò)表達(dá)慢病毒顆粒感染hPFF體外重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell iPSC）的關(guān)鍵技

2、術(shù)。
　　 方法：（1）采用Ⅰ型膠原酶消化法結(jié)合組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)hPFF，在倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，以臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力、免疫細(xì)胞化學(xué)方法染色鏈酶親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合法（Strept actividin-biotin complex SABC法）細(xì)胞鑒定。四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法 (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-trazolium bromide

3、MTT法)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。采用MMC處理hPFF制備細(xì)胞飼養(yǎng)層，MTT法篩選MMC作用的最佳濃度和時(shí)間；（2）將過(guò)表達(dá)綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）的空病毒顆粒感染hPFF，在熒光倒置顯微鏡下觀察感染效率及熒光表達(dá)情況，探索最佳感染條件及感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection，MOI值）；（3）將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的hPFF隨機(jī)分為3組：陰性對(duì)照組、含綠色熒光蛋白空病毒感染組

4、、目的基因感染組，采用含連續(xù)感染方式，在二次感染后4天給予hPFF干細(xì)胞培養(yǎng)條件,在倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察其形態(tài)變化，拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)三組細(xì)胞光譜，探索最佳培養(yǎng)條件。
　　 結(jié)果：（1）0.025％Ⅰ型膠原酶消化法結(jié)合組織塊培養(yǎng)法可以在體外建立穩(wěn)定的hPFF系，培養(yǎng)5d時(shí)即有細(xì)胞游走出，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、核仁明顯，7d時(shí)有較多的細(xì)胞游離出，匯集成束，10d左右細(xì)胞鋪滿瓶底，0.25％胰蛋白酶消化傳代。免疫細(xì)胞化學(xué)法SABC法鑒定細(xì)胞呈

5、陽(yáng)性結(jié)果。絲裂霉素 C 10μg/ml作用3.5h或15μg/ml作用2.5h能抑制hPFF增殖,細(xì)胞在1周內(nèi)維持穩(wěn)定的水平；(2)本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，慢病毒感染hPFF的最佳MOI值為40；（3）同等感染條件下，含綠色熒光蛋白空病毒感染組、陰性對(duì)照組的hPFF倒置顯微鏡下觀察形態(tài)未發(fā)生明顯改變，四個(gè)目的基因慢病毒混合感染組細(xì)胞偽足明顯收縮，形態(tài)由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形。拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照組與含綠色熒光蛋白空病毒感染組光譜圖沒(méi)有明顯