轉(zhuǎn)錄因子組合誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞直接重編程為汗腺樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　前期，我們團(tuán)隊(duì)已經(jīng)確證了建立一定的共培養(yǎng)條件可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為汗腺樣細(xì)胞，并經(jīng)裸鼠的腳掌創(chuàng)面模型試驗(yàn)和初步的人體試驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植于切除瘢痕的創(chuàng)面，可以生長(zhǎng)出汗腺樣結(jié)構(gòu)并且具有一定的發(fā)汗功能。本研究的主要目的是在前期工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)成纖維細(xì)胞重編程進(jìn)一步識(shí)別控制其分化為汗腺樣細(xì)胞的關(guān)鍵重編程轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB和Lef-1)及其介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)控通路，進(jìn)一步闡明成纖維細(xì)胞可能分化為汗

2、腺樣細(xì)胞的重編程機(jī)制，為利用其它多種類型細(xì)胞作為汗腺再生種子細(xì)胞，為臨床大面積汗腺損傷的患者實(shí)現(xiàn)汗腺再生帶來(lái)希望。
　　方法:
　　前期研究表明，調(diào)控成纖維細(xì)胞重編程為汗腺樣細(xì)胞關(guān)鍵信號(hào)通路涉及NF-κB和Lef-1等，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的參與調(diào)控胚胎發(fā)育過(guò)程汗腺細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展過(guò)程蛋白的變化，尋找出主要的參與調(diào)控關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和Lef-1的基因組合，分析其參與的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)一步驗(yàn)證其生物功能。
　　1.實(shí)驗(yàn)分組

3、與操作程序:待細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)密度達(dá)到80％以上時(shí)，按106個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于6孔板后采用完全隨機(jī)(完全隨機(jī)設(shè)計(jì)也叫組間設(shè)計(jì)，被試被分成若干組，每組分別接受一種實(shí)驗(yàn)處理，有幾種實(shí)驗(yàn)處理被試也相應(yīng)的被分為幾組，各實(shí)驗(yàn)組的被試之間相互獨(dú)立，因而又叫“獨(dú)立組”設(shè)計(jì))將其分為3組(每組的樣本量為5)，①目的基因轉(zhuǎn)染組:將所構(gòu)建的含有NF-κB和Lef-1基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞并篩選出穩(wěn)定表達(dá)的單克隆，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用;②空載

4、體組:將pcDNA3.1(+)空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并篩選出穩(wěn)定表達(dá)的單克隆，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用;③空白對(duì)照組:不轉(zhuǎn)染目的基因，相同實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)。
　　2.NF-κB和Lef-1基因?qū)θ顺衫w維細(xì)胞的重編程:
　　2.1真核表達(dá)載體的構(gòu)建:在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center ofBiotechnology Information，NCBI)上查找實(shí)驗(yàn)所需人NF-κB和Lef-1的基因序列，根據(jù)所查序列和實(shí)驗(yàn)需要分

5、別設(shè)計(jì)NF-κB和Lef-1基因開放閱讀框(open reading frame，ORF)PCR引物，用總RNA提取試劑盒提取人成纖維細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶的作用合成目的cDNA，將cDNA和pcDNA3.1(+)載體分別用HindⅢ/SalⅠ及HindⅢ/PstⅠ雙酶切并連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α擴(kuò)增，為了驗(yàn)證NF-κB和Lef-1目的基因序列是否有突變，將含有重組子的菌液送華大基因測(cè)序，選取無(wú)突變的單克隆菌液保種，經(jīng)測(cè)序正確后提

6、取質(zhì)粒，并檢測(cè)所提取質(zhì)粒濃度。
　　2.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞并篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系:將所培養(yǎng)的細(xì)胞以5000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，用不同濃度的G418培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，以10～14 d殺死全部細(xì)胞的濃度為基本濃度，并以此確定篩選濃度和維持濃度。轉(zhuǎn)染前一天按106個(gè)/孔的密度將所培養(yǎng)細(xì)胞接種于6孔板，按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的標(biāo)準(zhǔn)程序轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后用含G418的培養(yǎng)基按800mg/L的濃度篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，2周后以200 mg/L的濃度維持

7、篩選壓力，挑選并在96孔板中培養(yǎng)成陽(yáng)性單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用Realtime-PCR檢測(cè)3組細(xì)胞NF-κB和Lef-1的mRNA表達(dá)情況。
　　3.NF-κB和Lef-1重編程人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后變化:
　　EDA-A1能促進(jìn)正常和外胚層發(fā)育缺陷小鼠的汗腺、毛囊等外胚層組織器官的發(fā)育，EGF能提高M(jìn)SCs分化為SGLCs的誘導(dǎo)率。因此，本實(shí)驗(yàn)采用1μg/ml EDA-A1、50 ng/ml EG

8、F加入培養(yǎng)基誘導(dǎo)重編程后的人成纖維細(xì)胞分化為SGLCs。
　　3.1汗腺標(biāo)志物的檢測(cè):應(yīng)用免疫熒光法鑒定NF-κB和Lef-1重編程人成纖維細(xì)胞的汗腺相關(guān)分子如CEA，CK7，CK14和CK19等的表達(dá);應(yīng)用Western blot技術(shù)從蛋白層面檢測(cè)NF-κB和Lef-1重編程人成纖維細(xì)胞的汗腺相關(guān)分子CEA，CK7，CK14和CK19等的表達(dá)變化;應(yīng)用Realtime-PCR定量檢測(cè)NF-κB和Lef-1重編程人成纖維細(xì)胞的汗腺

9、相關(guān)分子CEA，CK7，CK14和CK19等的表達(dá)變化。
　　3.2 NF-κB和Lef-1通路下游基因的檢測(cè):應(yīng)用Realtime-PCR定量檢測(cè)NF-κB和Lef-1重編程人成纖維細(xì)胞的NF-κB和Lef-1通路關(guān)鍵下游基因Shh和Cyclin D1的表達(dá)變化。
　　3.3裸鼠腳掌移植實(shí)驗(yàn):應(yīng)用前期實(shí)驗(yàn)所建立的裸鼠模型探究重編程汗腺樣細(xì)胞的功能以及汗腺再生修復(fù)作用。將轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)-NF-κB和pc DNA

10、3.1(+)-Lef-1的實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞和另外兩組對(duì)照組的成纖維細(xì)胞以1×106個(gè)細(xì)胞制成的150μl混懸液用注射器植入裸鼠燙傷后的腳掌，20天后進(jìn)行組織學(xué)檢查和發(fā)汗實(shí)驗(yàn)觀察重編程汗腺樣細(xì)胞的生物學(xué)功能，并進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果:
　　1.NF-κB和Lef-1真核表達(dá)載體構(gòu)建:NF-κB和Lef-1基因的基因開放閱讀框(open reading frame，ORF)克隆進(jìn)pcDNA3.1(+)載體，經(jīng)HindⅢ/Sa

11、lⅠ及HindⅢ/PstⅠ雙酶切后瓊脂糖電泳分別可見相對(duì)分子質(zhì)量約為3000 bp和1200 bp的條帶，經(jīng)測(cè)序鑒定堿基對(duì)無(wú)突變，表明成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)-NF-κB和pcDNA3.1(+)-Lef-1真核表達(dá)載體。
　　2.G418篩選及NF-κB和Lef-1表達(dá)檢測(cè):G418培養(yǎng)液遞增篩選2周后未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞全部死亡，維持篩選20 d后形成陽(yáng)性克隆。
　　Realtime-PCR結(jié)果顯示，目的基因轉(zhuǎn)染組、空

12、載體組、空白對(duì)照組的NF-κBmRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為3.651±0.062、0.987±0.098、1.118±0.024，Lef-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為2.451±0.032、0.997±0.078、1.158±0.043，表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人成纖維細(xì)胞的NF-κB和Lef-1 mRNA的表達(dá)也顯著增加，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，與空載體組相比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，可認(rèn)為重組載體在細(xì)胞內(nèi)已

13、有較高轉(zhuǎn)錄水平。
　　3.汗腺標(biāo)志物的檢測(cè):Western-blot結(jié)果顯示，pcDNA3.1(+)-NF-κB和pcDNA3.1(+)-Lef-1轉(zhuǎn)染組中CEA，CK7，CK14和CK19蛋白均有明顯地表達(dá)，而空載體組、空白對(duì)照組中均未看見有表達(dá)。Realtime-PCR結(jié)果顯示，pcDNA3.1(+)-NF-κB和pcDNA3.1(+)-Lef-1轉(zhuǎn)染組中CEA，CK7，CK14和CK19 mRNA均有明顯地表達(dá)，而空載體組、

14、空白對(duì)照組中均未看見有表達(dá)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，pcDNA3.1(+)-NF-κB和pcDNA3.1(+)-Lef-1轉(zhuǎn)染組中CEA，CK7，CK14和CK19熒光亮度很強(qiáng)，而其他兩個(gè)對(duì)照組相同蛋白的熒光基本上看不見。
　　4.NF-κB和Lef-1通路下游基因的檢測(cè):
　　Realtime-PCR結(jié)果顯示，目的基因轉(zhuǎn)染組、空載體組、空白對(duì)照組的ShhmRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為3.151±0.052、0.997±0.038

15、、1.098±0.074，Cyclin D1mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為2.653±0.045、0.997±0.048、1.118±0.053，表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人成纖維細(xì)胞的Shh和Cyclin D1 mRNA的表達(dá)也顯著增加，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，與空載體組相比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，可認(rèn)為被公認(rèn)參加汗腺再生過(guò)程中很重要的Shh和Cyclin D1在細(xì)胞內(nèi)已有較高轉(zhuǎn)錄水平。
　　5.裸鼠腳掌移

16、植實(shí)驗(yàn):
　　20天后進(jìn)行的碘淀粉發(fā)汗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大約7/10的實(shí)驗(yàn)組腳掌為陽(yáng)性結(jié)果，在腳掌中間可以明顯的看到藍(lán)黑色的區(qū)域，而兩組對(duì)照則沒(méi)有看到相應(yīng)的陽(yáng)性結(jié)果。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，目的基因轉(zhuǎn)染組的裸鼠腳掌HE染色切片中可以看到有汗腺的再生，基底層汗腺導(dǎo)管相連接，而對(duì)照組則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)汗腺結(jié)構(gòu)的再生。冰凍切片中可看見ck7和ck19的紅色熒光。移植瘤實(shí)驗(yàn)證明了汗腺樣細(xì)胞的安全性。
　　結(jié)論:
　　NF-κB和Lef-1的基因組

17、合可以直接重編程人成纖維細(xì)胞分化成汗腺樣細(xì)胞，在誘導(dǎo)成汗腺樣細(xì)胞的過(guò)程中汗腺特異性標(biāo)志物CEA，CK7，CK14和CK19的表達(dá)有明顯的表達(dá)，并且通過(guò)檢測(cè)通路下游基因Shh和Cyclin D1證實(shí)了NF-κB和Lef-1這兩條通路在直接重編程過(guò)程中的重要作用。直接重編程后的人成纖維細(xì)胞在裸鼠模型中得到了生物學(xué)功能的驗(yàn)證，為利用其它多種類型細(xì)胞進(jìn)行汗腺樣細(xì)胞重編程、實(shí)現(xiàn)汗腺再生奠定理論基礎(chǔ)，為臨床大面積汗腺損傷的患者實(shí)現(xiàn)汗腺再生帶來(lái)希望。