銅綠假單胞菌pvdQ基因?qū)θ杭\動中抗生素抗性的影響及作用機制的研究.pdf

1、目的：觀察銅綠假單胞菌pvdQ基因?qū)θ杭\動（Swarming motility）中抗生素抗性的影響及作用機制的研究。構建銅綠假單胞菌?；妇幋a基因pvdQ基因的高表達株和突變株，觀察pvdQ基因?qū)θ杭\動的影響及在群集運動條件下對抗生素抗性的改變及其作用的機制。
　　 方法：利用電穿孔的方法構建pvdQ基因的空質(zhì)粒株、高表達株和突變株，并用熒光定量PCR比較上述三種菌株在銅綠假單胞菌PAO1 野生株中的表達。將PAO1 野生株

2、、pvdQ基因的空質(zhì)粒株、高表達株和突變株分別置于群集運動瓊脂培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，觀察比較群集運動直徑的大小。用E 試驗法測PAO1 野生株和pvdQ基因的高表達株的MIC 值。根據(jù)MIC 值將PAO1 野生株和pvdQ基因的高表達株置于含有不同濃度抗生素的培養(yǎng)皿中過夜培養(yǎng)，比較兩者群集運動直徑的大小。將PAO1 野生株和高表達株在電鏡下觀察群集運動細胞的形態(tài)。采用結晶紫染色法，觀察比較PAO1 野生株和pvdQ基因的高表達株培養(yǎng)24h，

3、24h和72h的生物膜的生長情況。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察PAO1 野生株和pvdQ基因的高表達株生長24h，24h和72h 時生物膜的厚度。用熒光染料NPN在熒光分光光度計中比較PAO1 野生株和pvdQ 高表達株對膜通透性的改變。采用熒光定量PCR法比較PAO1和pvdQ 高表達株多重耐藥外排泵MexAB-OprM的oprM基因和MexGHI-opmD的mexI基因的表達。
　　 結果：熒光定量PCR結果顯示，成功構建p

4、vdQ基因空質(zhì)粒株、高表達株和突變株。比較四株菌的群集運動直徑變化：空質(zhì)粒株與PAO1 野生株相比較，直徑無顯著變化；突變株與PAO1 野生株相比較，直徑減??；高表達株與PAO1野生株相比較，直徑增大。E 試驗結果顯示銅綠假單胞菌對上述5中抗生素均敏感，而PAO1 野生株和pvdQ 高表達株之間差異不明顯。比較PAO1 野生株和pvdQ高表達株兩株菌在含有不同濃度抗生素的培養(yǎng)皿中群集運動直徑大?。嚎股貪舛瘸杀对黾樱杭\動直徑不是成

5、倍下降而是成不規(guī)則增加，說明PAO1 野生株和高表達株均能提高抗生素抗性；PAO1在頭孢他啶濃度>8μg/ml，環(huán)丙沙星濃度>0.4μg/ml，美羅培南濃度>4μg/ml，多粘菌素B 濃度>16μg/ml，慶大霉素>8μg/ml 時群集運動被抑制；而pvdQ 高表達株是在頭孢他啶濃度>32μg/ml，環(huán)丙沙星濃度>1.6μg/ml，美羅培南濃度>16μg/ml，多粘菌素B 濃度>64μg/ml，慶大霉素濃度>64μg/ml 時群集運動被

6、抑制。因此，pvdQ 高表達株與PAO1 野生株相比抗性提高了2-8倍。電鏡觀察結果：pvdQ高表達株分化的群集細胞與PAO1 野生株相比較細胞變長，核質(zhì)增多。結晶紫染色的結果顯示：培養(yǎng)24h PAO1 野生株、高表達株和突變株形成的生物膜厚度差異無統(tǒng)計學意義，培養(yǎng)48h和72h 時與PAO1 野生株相比高表達株生物膜明顯變薄，PAO1 野生株與突變株相比較突變株生物膜明顯增厚。
　　 用激光共聚焦顯微鏡觀察PAO1 野生株和p

7、vdQ 高表達株在培養(yǎng)12h，24h和72h 時生物膜的厚度，結果發(fā)現(xiàn)：72hpvdQ 高表達株較PAO1 野生株生物膜明顯變薄。將pvdQ基因與外膜通透性、多重耐藥外排泵基因做了相關性的研究，研究結果顯示：pvdQ高表達株與PAO1 野生株相比較，pvdQ 高表達株能夠明顯降低外膜通透性。對多重耐藥外排泵基因表達的結果顯示：oprM基因和mexI基因在群集細胞中，PAO1 野生株和pvdQ 高表達株的表達明顯高于浮游細菌細胞，但群集細

8、胞之間的比較PAO1 野生株和pvdQ 高表達株的oprM基因和mexI基因表達無明顯差異。
　　 結論：pvdQ 高表達株促進群集運動直徑，突變株則抑制群集運動直徑，說明pvdQ基因可能參與調(diào)控銅綠假單胞菌PAO1 野生株的群集運動。在群集運動條件下銅綠假單胞菌pvdQ 高表達株與PAO1 野生株相比較能夠?qū)㈩^孢他啶、環(huán)丙沙星、美羅培南、多粘菌素B和慶大霉素的抗性提高2-8倍，細菌群集運動被抑制的抗生素濃度均顯著性的高于MIC