2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種機(jī)會(huì)致病菌,它可以在人群中引起嚴(yán)重的急性和慢性感染,是病人在醫(yī)院期間發(fā)生感染的第三大致病菌。許多抗生素對其有一定的治療作用,但銅綠假單胞菌有一個(gè)重要特性是它對許多抗生素具有很高的內(nèi)在抗藥性。因此研究哦銅綠家擔(dān)保久的抗藥性激勵(lì)、研究其致病性肌和開發(fā)新的抗銅綠假單胞菌藥物是當(dāng)前微生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要課題。 一、微生物在生長過程中分泌許多次級(jí)代謝產(chǎn)物,吩嗪作為其代謝產(chǎn)

2、物中的一類,除在傳統(tǒng)意義上作為一種抗生素及致病因子外,最近的研究表明,吩嗪中的許多衍生物(如:pyocyanin)還能作為一種信號(hào)分子,對許多基因的表達(dá)具有明顯的調(diào)節(jié)作用。基于吩嗪在微生物生命活動(dòng)中的重要性,在基因水平上研究了吩嗪合成基因的調(diào)節(jié)機(jī)理。對phzA1B1C1D1E1F1G1(phzA1)啟動(dòng)子的具體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究并對該操縱子受其自身產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)進(jìn)行了探索。結(jié)果表明: 1.吩嗪合成操縱子phzA1的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)構(gòu)極為復(fù)

3、雜,含有兩個(gè)las—box,是群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum—Sensing Systems)對其調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn):通過基因缺失,將不同長度啟動(dòng)子區(qū)域DNA片斷與帶luxCDABE的報(bào)道質(zhì)粒pMS402相連,檢測表達(dá)活性,確定了其調(diào)節(jié)部位,證實(shí)啟動(dòng)子域上的第一個(gè)las—box(翻譯起始位點(diǎn)上游326 bp)是其QS調(diào)節(jié)所必需,同時(shí)也是啟動(dòng)本身活性所必需的; 2.通過對吩嗪合成phzA1操縱子中基因phzA1、phzC1和phz

4、E1分別進(jìn)行敲除,發(fā)現(xiàn)吩嗪終產(chǎn)物綠膿菌素( pyocyanin)產(chǎn)量幾乎消失。而構(gòu)建好的phzA1啟動(dòng)子—luxCEABE為報(bào)道子的融合體Mini—CTX—phzA1在這些突變體的表達(dá)卻顯著增強(qiáng),這說明phzA1受其自身產(chǎn)物吩嗪的負(fù)調(diào)節(jié)。 3.由于吩嗪產(chǎn)物與群體感應(yīng)系統(tǒng)具有密切的調(diào)控關(guān)系,而且研究表明綠膿菌素是QS的終極信號(hào)分子,我們推測群體感應(yīng)系統(tǒng)可能也受吩嗪產(chǎn)物的調(diào)節(jié)。因此,我們測定了群體感應(yīng)系統(tǒng)基因(las, rhl以及p

5、qs)在phzA1突變體中的表達(dá)水平,lasR和rhlI在phzA1突變體中的表達(dá)提高約3倍,而其它表達(dá)融合體沒有明顯區(qū)別。結(jié)果說明吩嗪自身的合成受到群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)外,它作為一種信號(hào)分子,反過來對群體感應(yīng)系統(tǒng)具有反饋調(diào)節(jié)作用。 二、抗生素作為自然界中一部分菌體分泌出來的一種化學(xué)物,它除傳統(tǒng)的殺菌或抑菌外,還表現(xiàn)出了其它的一些活性。在低于最小抑制濃度(Minimal Inlubitory Concentration,MIC)條件

6、下,它作為一種化學(xué)信號(hào)物對許多基因的表達(dá)起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究低于最小抑制濃度抗生素將有助于我們更好的了解病原菌的致病性和耐藥性,從而找到細(xì)菌對抗生素的耐藥靶點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中,研究了低于抑制濃度的抗生素對基因表達(dá)調(diào)節(jié)的具體機(jī)理。結(jié)果表明: (1)低于抑制濃度抗生素對銅綠假單胞菌中致病因子庫中的許多致病因子具有調(diào)節(jié)作用。如:吩嗪合成基因操縱子phzA1受到低于抑制濃度四環(huán)素的強(qiáng)烈激活作用。 (2)為了更好地了解基因表達(dá)受抗

7、生素調(diào)節(jié)的具體途徑,我們通過轉(zhuǎn)座突變的方法,以受四環(huán)素(Tetracycline)調(diào)節(jié)的吩嗪合成基因操縱子phzA1為研究對象,找到了12個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)基因,這些基因能使四環(huán)素對phzA1的調(diào)節(jié)程度降低;18個(gè)正調(diào)節(jié)基因,它們促使四環(huán)素對phzA1的調(diào)節(jié)程度提高;更重要的是,PA1196和PA0487基因發(fā)生突變后,phzA1不再受四環(huán)素的調(diào)節(jié);這些結(jié)果對于抗生素在低于抑制濃度條件下,作為一種信號(hào)分子對基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制的理解,提供了非常重要的

8、理論基礎(chǔ)。 (3)由于吩嗪的合成受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的嚴(yán)格控制,上述篩選到的影響吩嗪合成的突變體可能和群體感應(yīng)系統(tǒng)之間存在著某些聯(lián)系。為了驗(yàn)證這種假設(shè),檢測了群體感應(yīng)系統(tǒng)基因在這些突變體中的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了數(shù)個(gè)調(diào)節(jié)基因的調(diào)控途徑,如:PA0964(PmpR)基因?qū)?xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum—Sensing Systems)具有明顯的調(diào)節(jié)作用。 (4)為了進(jìn)一步確定PA0964是直接還是間接調(diào)節(jié)群體感應(yīng)系統(tǒng),在體外表達(dá)

9、蛋白(PA0964),通過EMSA實(shí)驗(yàn)表明,它通過直接結(jié)合在pqsR上來調(diào)節(jié)其它致病因子的表達(dá)。PA0964屬于成員數(shù)目龐大的功能未知基因家族(yebC家族),揭示了一個(gè)新的群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)途徑,同時(shí)為研究整個(gè)yebC家族基因的功能提供了一個(gè)經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的線索。 群體感應(yīng)系統(tǒng)在細(xì)菌致病性的調(diào)控方面起到重要作用,包括生物膜的形成、毒素的產(chǎn)生、侵染的過程等。近年來的研究表明,干擾細(xì)菌的QS系統(tǒng)可以作為潛在的防治細(xì)菌病害的新途徑。該途

10、徑主要是以群體感應(yīng)調(diào)控蛋白間的競爭和降解自體誘導(dǎo)物的方式對目標(biāo)菌株進(jìn)行信號(hào)干擾(Quorum quenching),從而降低致病菌的致病能力來達(dá)到控制病原菌感染的目的。 三、通過轉(zhuǎn)座突變的方法,篩選了一些對吩嗪合成基因phzA1有調(diào)節(jié)的突變體。在這些突變體中,有一個(gè)突變體的表型發(fā)生了很大的變化,在固體和液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),其顏色由原來的綠色變成了白色。我們通過隨機(jī)PCR和測序,確定轉(zhuǎn)座子插入在PA2593基因的啟動(dòng)子區(qū)域。鑒于該

11、突變體以上的表型及其特征變化,我們在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究了該突變體的特性以及該基因的功能,結(jié)果表明: 1.在銅綠假單胞菌中過量表達(dá)該基因,和轉(zhuǎn)座插入突變一樣,銅綠假單胞菌在固體和液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí),其顏色發(fā)生了明顯的變化,吩嗪產(chǎn)量明顯降低; 2.由于吩嗪的合成受群體感應(yīng)系統(tǒng)的嚴(yán)格控制,于是我們檢測了群體感應(yīng)系統(tǒng)中的信號(hào)分子的量(C4—HSL和C12-HSL),兩者的量也明顯減少;同時(shí),群體感應(yīng)系統(tǒng)中的第三類信號(hào)分子PQ

12、S的產(chǎn)量也明顯減少;群體感應(yīng)系統(tǒng)基因(las, rhl)在過量表達(dá)菌中的表達(dá)水平明顯下降; 3.由于群體感應(yīng)系統(tǒng)信號(hào)分子的量明顯減少,而銅綠假單胞菌中的群體感應(yīng)系統(tǒng)控制著本身許多致病因子的表達(dá)。于是我們測定了一些受群體感應(yīng)系統(tǒng)嚴(yán)格控制的生物學(xué)表型。在銅綠假單胞菌中過量表達(dá)PA2593基因后,其分解蛋白酶的能力減弱,彈性蛋白酶和鼠李糖酯的量也明顯減少; 4.以上這些表型在PA2593基因突變體中卻沒有明顯的變化,其本身在一

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