蛋白質(zhì)組學(xué)在多發(fā)性硬化與視神經(jīng)脊髓炎血清和腦脊液中的研究.pdf

1、研究背景:
　　 多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)及視神經(jīng)脊髓炎(Neuromyelitis optica,NMO)均是病因不明的中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫性脫髓鞘疾病,病理過程主要是脫髓鞘改變,臨床表現(xiàn)依中樞神經(jīng)系統(tǒng)累及的部位不同而呈現(xiàn)多樣化。
　　 多發(fā)性硬化及視神經(jīng)脊髓炎雖同屬中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病,但兩者在發(fā)病機(jī)制、病理表現(xiàn)、臨床特點(diǎn)、治療方案等方面有諸多不同,尤其是在NMO患者血清中發(fā)現(xiàn)自身抗體NM

2、O-IgG后,目前更傾向NMO并非是MS的一種亞型而是一個(gè)獨(dú)立的疾病。但由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織標(biāo)本的不易獲取,阻礙了對(duì)MS及NMO病理機(jī)制的進(jìn)一步研究,而體液作為內(nèi)環(huán)境的重要組成部分,其所含有的多肽、蛋白質(zhì)和酶類在生理過程中起到非常重要的作用,其蛋白與多肽的質(zhì)和量的變化,能精確反映機(jī)體疾病狀態(tài)下的病理生理過程,MS及NMO復(fù)雜的免疫應(yīng)答引起腦脊液、血清、腦組織、各種亞細(xì)胞器中蛋白質(zhì)種類和數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化。鑒于此,可以通過研究MS和NMO血清

3、及腦脊液中特定蛋白的變化,獲得反應(yīng)疾病的發(fā)生、進(jìn)展、以及機(jī)體對(duì)疾病產(chǎn)生的代償機(jī)制如神經(jīng)保護(hù)、組織重塑、炎癥反應(yīng)等信息。
　　 蛋白質(zhì)組(Proteome)概念的內(nèi)容主要包括對(duì)全蛋白質(zhì)的定性、定量和從功能角度分析大量蛋白質(zhì),這是一個(gè)整體的、動(dòng)態(tài)的概念。蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)是指根據(jù)蛋白質(zhì)種類、數(shù)量、局部存在的時(shí)間、空間上的變化來(lái)研究表達(dá)于細(xì)胞、組織及個(gè)體中的全部蛋白質(zhì)(proteome),并從其結(jié)構(gòu)和功能的角度綜合分析

4、生命活動(dòng)的一門科學(xué)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究最顯著的特點(diǎn)是能對(duì)生理與病理狀態(tài)下的體液、組織或細(xì)胞中蛋白質(zhì)組分進(jìn)行大通量的綜合分析,這有助于對(duì)復(fù)雜多變的神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)行較為全面的認(rèn)識(shí)。
　　 本實(shí)驗(yàn)即對(duì)MS及NMO患者的血清和腦脊液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究,進(jìn)行蛋白分離、蛋白鑒定,分析探討MS、NMO各自的血清和腦脊液蛋白組學(xué)特點(diǎn)以及行兩者之間的比較研究,以期深入探討兩者的病理機(jī)制,并對(duì)MS、NMO的診斷及兩者的鑒別診斷提供一定的輔助依據(jù)。

5、>　　 第一部分 MS患者血清和腦脊液的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.
　　 目的:
　　 建立MS血清和腦脊液2D電泳圖譜,分別觀察MS與正常對(duì)照組血清和腦脊液2D電泳的表達(dá)差異；對(duì)差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行鑒定,并探討其意義。
　　 方法:
　　 1.采集MS組和正常對(duì)照組血清和腦脊液,進(jìn)行全蛋白提取、Bradford法蛋白定量。
　　 2.分別將血清和腦脊液樣品均等份混合后重復(fù)跑2D電泳三遍,第一向?yàn)榈入娔勰?/p>

6、膠電泳,第二向?yàn)镾DS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
　　 3.硝酸銀染法染后,并應(yīng)用ImageMaster2D Platinum5.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。
　　 4.分別比較血清和腦脊液結(jié)果,選擇兩組間感興趣的蛋白點(diǎn)(兩組2D電泳圖譜中點(diǎn)體積百分比差異兩倍以上或者具有有無(wú)差異的點(diǎn))切膠取樣、酶解消化,以高敏度HD—ms／ms質(zhì)譜分析進(jìn)行蛋白鑒定。
　　 5.利用MASCOT在線軟件進(jìn)行檢索蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)果:<

7、br>　　 (一)血清結(jié)果.
　　 1.MS組血清2D電泳凝膠圖譜共獲得414個(gè)蛋白點(diǎn),正常對(duì)照組血清2D電泳凝膠圖譜共獲得476個(gè)蛋白點(diǎn)。
　　 2.MS組與正常對(duì)照組血清2D電泳凝膠圖譜相比,匹配蛋白點(diǎn)為345個(gè),MS組相比正常組表達(dá)上調(diào)的蛋白點(diǎn)159個(gè),其中上調(diào)差異大于2倍以上的蛋白點(diǎn)42個(gè),表達(dá)下調(diào)的蛋白點(diǎn)186個(gè)。兩組未匹配的蛋白點(diǎn),MS組69個(gè),正常對(duì)照組131個(gè)。
　　 3.MS組血清2D電泳凝膠

8、圖譜與正常對(duì)照組相比未表達(dá)的蛋白點(diǎn)共81個(gè)。
　　 4.通過HD—ms／ms質(zhì)譜分析和MASCOT網(wǎng)絡(luò)檢索,鑒定兩個(gè)差異蛋白質(zhì):免疫球蛋白九和角蛋白83,前者僅見于多發(fā)性硬化血清2D凝膠圖譜,后者在MS組中的表達(dá)比正常對(duì)照組差異遠(yuǎn)大于2倍。
　　 (二)腦脊液結(jié)果.
　　 1.MS組CSF2D電泳凝膠圖譜共獲得118個(gè)蛋白點(diǎn),正常對(duì)照組CSF的2D電泳凝膠圖譜共獲得350個(gè)蛋白點(diǎn)。
　　 2.MS組與正常

9、對(duì)照組CSF2D電泳凝膠圖譜相比,匹配蛋白點(diǎn)為51個(gè),MS組相比正常組表達(dá)上調(diào)的蛋白點(diǎn)38個(gè),其中上調(diào)差異大于2倍以上的蛋白點(diǎn)24個(gè),表達(dá)下調(diào)的蛋白點(diǎn)13個(gè)。兩組未匹配的蛋白點(diǎn),MS組67個(gè),正常對(duì)照組299個(gè)。
　　 3.通過HD—ms／ms質(zhì)譜分析和MASCOT網(wǎng)絡(luò)檢索,鑒定三個(gè)差異蛋白質(zhì):前白蛋白、角蛋白1和角蛋白9,前白蛋白僅見于多發(fā)性硬化CSF的2D凝膠圖譜,角蛋白1在MS組無(wú)表達(dá)而在正常對(duì)照組有表達(dá),角蛋白9在MS組

10、中的表達(dá)比正常對(duì)照組差異遠(yuǎn)大于2倍。
　　 結(jié)論:
　　 1.多發(fā)性硬化患者與正常對(duì)照組血清2D凝膠電泳圖譜對(duì)比有多種蛋白質(zhì)表達(dá)呈顯著差異。
　　 2.鑒定了兩個(gè)血清差異表達(dá)蛋白免疫球蛋白九(Ig lamda chain)和角蛋白83(keratin83)。免疫球蛋白λ高表達(dá)可能與MS的免疫機(jī)制相關(guān)。
　　 3.發(fā)性硬化患者與正常對(duì)照組CSF的2D凝膠電泳圖譜對(duì)比有多種蛋白質(zhì)表達(dá)呈顯著差異。
　　

11、 4.鑒定了三個(gè)腦脊液差異表達(dá)蛋白前白蛋白、角蛋白1和角蛋白9。
　　 第二部分 NMO患者血清和腦脊液的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
　　 目的:
　　 建立NMO血清和腦脊液2D電泳圖譜,分別觀察NMO與正常對(duì)照組血清和腦脊液2D電泳的表達(dá)差異；對(duì)差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行鑒定,并探討其意義。
　　 方法:
　　 1.采集NMO組和正常對(duì)照組血清和腦脊液,進(jìn)行全蛋白提取、Bradford法蛋白定量。
　　

12、 2.分別將血清和腦脊液樣品均等份混合后重復(fù)跑2D電泳三遍,第一向?yàn)榈入娔勰z電泳,第二向?yàn)镾DS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
　　 3.硝酸銀染法染后,并應(yīng)用ImageMaster2D Platinum5.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。
　　 4.分別比較血清和腦脊液結(jié)果,選擇兩組間感興趣的蛋白點(diǎn)(兩組2D電泳圖譜中點(diǎn)體積百分比差異兩倍以上或者具有有無(wú)差異的點(diǎn))切膠取樣、酶解消化,以高敏度HD—ms／ms質(zhì)譜分析進(jìn)行蛋白鑒定。

13、>　　 5.利用MASCOT在線軟件進(jìn)行檢索蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)果:
　　 (一)血清結(jié)果
　　 1.NMO組血清2D電泳凝膠圖譜共獲得472個(gè)蛋白點(diǎn),正常對(duì)照組血清2D電泳凝膠圖譜共獲得476個(gè)蛋白點(diǎn)。
　　 2.NMO組與正常對(duì)照組血清2D電泳凝膠圖譜相比,匹配蛋白點(diǎn)為374個(gè),NMO組相比正常組表達(dá)上調(diào)的蛋白點(diǎn)175個(gè),其中上調(diào)差異大于2倍以上的蛋白點(diǎn)57個(gè),表達(dá)下調(diào)的蛋白點(diǎn)199個(gè)。兩組未匹配的蛋

14、白點(diǎn),NMO組98個(gè),正常對(duì)照組102個(gè)。
　　 3.NMO組血清2D電泳凝膠圖譜與正常對(duì)照組相比未表達(dá)的蛋白點(diǎn)共52個(gè)。
　　 4.通過HD—ms／ms質(zhì)譜分析和MASCOT網(wǎng)絡(luò)檢索,鑒定一個(gè)差異蛋白質(zhì):觸珠蛋白Hp2,在NMO組中的表達(dá)比正常對(duì)照組差異遠(yuǎn)大于2倍。
　　 (二)腦脊液結(jié)果。
　　 1.NMO組CSF2D電泳凝膠圖譜共獲得155個(gè)蛋白點(diǎn),正常對(duì)照組CSF2D電泳凝膠圖譜共獲得350個(gè)蛋白

15、點(diǎn)。
　　 2.NMO組與正常對(duì)照組CSF2D電泳凝膠圖譜相比,匹配蛋白點(diǎn)為82個(gè),NMO組相比正常組表達(dá)上調(diào)的蛋白點(diǎn)64個(gè),其中上調(diào)差異大于2倍以上的蛋白點(diǎn)47個(gè),表達(dá)下調(diào)的蛋白點(diǎn)18個(gè)。兩組未匹配的蛋白點(diǎn),NMO組73個(gè),正常對(duì)照組268個(gè)。
　　 3.通過HD—ms／ms質(zhì)譜分析和MASCOT網(wǎng)絡(luò)檢索,鑒定三個(gè)差異蛋白質(zhì):角蛋白1、角蛋白9和轉(zhuǎn)鐵蛋白,三者在NMO組中的表達(dá)均比正常對(duì)照組差異遠(yuǎn)大于2倍。
　　

16、 結(jié)論:
　　 1.NMO患者與正常對(duì)照組血清2D凝膠電泳圖譜對(duì)比有多種蛋白質(zhì)表達(dá)呈顯著差異。
　　 2.鑒定了一個(gè)血清差異表達(dá)蛋白為觸珠蛋白。觸珠蛋白的高表達(dá)提示其在NMO免疫反應(yīng)中可能發(fā)揮一定免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 3.NMO患者與正常對(duì)照組CSF的2D電泳圖譜對(duì)比有多種蛋白質(zhì)表達(dá)呈顯著差異。
　　 4.鑒定了三個(gè)腦脊液差異表達(dá)蛋白細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白、角蛋白9、角蛋白1。
　　 5.轉(zhuǎn)鐵蛋白的腦脊液

17、高表達(dá)可能與NMO患者血腦屏障受損相關(guān),可能是NMO病理過程中BBB受損嚴(yán)重的一個(gè)反應(yīng)指標(biāo)。
　　 第三部分 MS與N]Mo患者血清和腦脊液的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
　　 目的:
　　 分別比較MS與NMO患者血清和腦脊液2D電泳的表達(dá)差異；對(duì)差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行鑒定,并探討其意義。
　　 方法:
　　 1.采集MS組與NMO組血清和腦脊液,進(jìn)行全蛋白提取、Bradford法蛋白定量。
　　 2.

18、分別將血清和腦脊液樣品均等份混合后重復(fù)跑2D電泳三遍,第一向?yàn)榈入娔勰z電泳,第二向?yàn)镾DS聚丙烯酰胺凝膠電泳。
　　 3.硝酸銀染法染后,并應(yīng)用ImageMaster2D Platinum5.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。
　　 4.分別比較血清和腦脊液結(jié)果,選擇兩組間感興趣的蛋白點(diǎn)(兩組2D電泳圖譜中點(diǎn)體積百分比差異兩倍以上或者具有有無(wú)差異的點(diǎn))切膠取樣、酶解消化,以高敏度HD—ms／ms質(zhì)譜分析進(jìn)行蛋白鑒定。
　　

19、 5.利用MASCOT在線軟件進(jìn)行檢索蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)果:
　　 (一)血清結(jié)果。
　　 1.MS組血清2D電泳凝膠圖譜共獲得414個(gè)蛋白點(diǎn),NMO組血清2D電泳凝膠圖譜共獲得472個(gè)蛋白點(diǎn)。
　　 2.正常組血清有表達(dá)且同時(shí)在MS組血清有表達(dá)而在NMO組血清無(wú)表達(dá)的蛋白點(diǎn)為52個(gè),正常組血清有表達(dá)且同時(shí)在NMO組血清有表達(dá)而在MS組血清無(wú)表達(dá)的蛋白點(diǎn)為81個(gè)。
　　 3.通過HD—ms／ms

20、質(zhì)譜分析和MASCOT網(wǎng)絡(luò)檢索,鑒定二個(gè)差異蛋白質(zhì):角蛋白83和觸珠蛋白Hp2。角蛋白83和觸珠蛋白Hp2,兩者在MS組和NMO組中均有表達(dá),前者在MS組血清中與NMO組相比表達(dá)遠(yuǎn)大于2倍,后者在NMO組血清中與MS組表達(dá)遠(yuǎn)大于2倍。
　　 (二)腦脊液結(jié)果
　　 1.MS組CSF2D電泳凝膠圖譜共獲得118個(gè)蛋白點(diǎn),NMO組CSF2D電泳凝膠圖譜共獲得155個(gè)蛋白點(diǎn)。
　　 2.正常組CSF有表達(dá)且同時(shí)在NMO

21、組CSF有表達(dá)而在MS組CSF無(wú)表達(dá)的蛋白點(diǎn)為45個(gè),正常組CSF有表達(dá)且同時(shí)在NMO組CSF無(wú)表達(dá)而在MS組CSF有表達(dá)的蛋白點(diǎn)為14個(gè)。
　　 3.通過HD—ms／ms質(zhì)譜分析和MASCOT網(wǎng)絡(luò)檢索,鑒定二個(gè)差異蛋白質(zhì):前自蛋白和角蛋白1,前白蛋白在MS組CSF中有表達(dá)而在NMO組和正常對(duì)照組CSF中無(wú)表達(dá)；角蛋白1在NMO組CSF中有表達(dá)而在MS組CSF中無(wú)表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.MS患者與NMO患