燈盞乙素及其芐酯衍生物對(duì)心肌細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究燈盞乙素及其芐酯衍生物對(duì)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用,并探討其可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、采用新生1～3d的SD大鼠體外原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞。
　　 2、采用MTT法檢測(cè)不同缺氧時(shí)間心肌細(xì)胞的生長狀態(tài),從而確定最佳缺氧時(shí)間,建立體外缺氧損傷模型。
　　 3、將搏動(dòng)狀態(tài)良好,生長密度無明顯差異的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、缺氧損傷模型組、燈盞乙素組(高、中、低劑量組:100gμmol/L

2、、50μmol/L、25μmol/L)和燈盞乙素芐酯衍生物組(高、中、低劑量組:100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L)(缺氧前分別加入干預(yù)藥物)。
　　 4、缺氧處理后,采用生化手段檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮(NO)活性,研究燈盞乙素及其芐酯衍生物對(duì)心肌細(xì)胞膜缺氧損傷的保護(hù)作用。
　　 5、檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性及脂質(zhì)氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量,研究

3、燈盞乙素及其芐酯衍生物對(duì)心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷的保護(hù)作用。
　　 6、采用H.E及Hochest-PI染色觀察燈盞乙素及其芐酯衍生物對(duì)缺氧心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。
　　 7、采用流式細(xì)胞術(shù),研究燈盞乙素及其芐酯衍生物對(duì)缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡率的影響。
　　 8、采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組Bcl-2、Bax、Cytochrome c、Caspase-3基因在mRNA水平的表達(dá)差異。
　　 9、通過Wes

4、tern Blot法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組Bcl-2、Bax、Cytochrome c、Caspase-3基因在蛋白水平的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果:
　　 1、缺氧時(shí)間點(diǎn)的確定:心肌細(xì)胞缺氧損傷0-6h,細(xì)胞活性變化幅度最大,單位時(shí)間內(nèi)細(xì)胞缺氧損傷程度最大,確定6h為最佳缺氧時(shí)間點(diǎn)。
　　 2、生化指標(biāo)測(cè)定:與正常對(duì)照組比較,模型組心肌細(xì)胞LDH的外漏量增加(P＜0.01),NO釋放量減少(P＜0.01),細(xì)胞內(nèi)SOD活性下

5、降(P＜0.01),MDA含量升高(P＜0.01);各劑量的燈盞乙素及其芐酯衍生物可顯著降低缺氧損傷心肌細(xì)胞LDH的外漏量(P＜0.01);高、中劑量的燈盞乙素及其芐酯衍生物可明顯增加缺氧損傷心肌細(xì)胞NO釋放量(P＜0.01);各劑量的燈盞乙素及高、中劑量的芐酯衍生物可提高缺氧損傷細(xì)胞內(nèi)SOD活性(P＜0.01),高劑量的燈盞乙素及其芐酯衍生物可減少缺氧損傷心肌細(xì)胞MDA的產(chǎn)生(P＜0.05)。
　　 3、H.E染色及Hoche

6、st-PI染色:高劑量的燈盞乙素及其芐酯衍生物可有效減輕缺氧損傷心肌細(xì)胞染色質(zhì)凝集、細(xì)胞核固縮等凋亡形態(tài)學(xué)變化。
　　 4、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):與正常對(duì)照組比較,模型組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.01),各劑量的燈盞乙素及高、中劑量的芐酯衍生物可明顯降低缺氧損傷細(xì)胞凋亡的百分率(P＜0.01)。
　　 5、RT-PCR結(jié)果:模型組bcl-2 mRNA的表達(dá)量較正常組顯著降低(P＜0.01),各劑量的燈盞乙素及高、中劑量的

7、芐酯衍生物可顯著上凋缺氧損傷心肌細(xì)胞內(nèi)bcl-2 mRNA的表達(dá)(P＜0.01);模型組bax mRNA的表達(dá)量較正常組顯著升高(P＜0.01),各劑量的燈盞乙素及高、中劑量的芐酯衍生物可顯著降低細(xì)胞中bax mRNA的表達(dá)(P＜0.01);模型組Cvtochrome c mRNA表達(dá)水平較正常組顯著升高(P＜0.01),各劑量的燈盞乙素及其芐酯衍生物可顯著降低細(xì)胞Cytochrome c mRNA的表達(dá)(P＜0.01);模型組Casp

8、ase-3 mRNA表達(dá)水平較正常組顯著升高(P＜0.01);各劑量的燈盞乙素及高、中劑量的芐酯衍生物可顯著降低細(xì)胞Caspase-3 mRNA的表達(dá)(P＜0.01)。
　　 6、Western Blot結(jié)果:模型組Bcl-2蛋白的表達(dá)量較正常組顯著降低(P＜0.01),各劑量的燈盞乙素及高、中劑量的芐酯衍生物可顯著上凋缺氧損傷心肌細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá)(P＜0.01);模型組Bax蛋白的表達(dá)量較正常組顯著升高(P＜0.01

9、),各劑量的燈盞乙素及高、中劑量的芐酯衍生物可顯著降低細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)(P＜0.01):模型組Cytochromec蛋白表達(dá)水平較正常組顯著升高(P＜0.01),各劑量的燈盞乙素及其芐酯衍生物可顯著降低細(xì)胞Cytochrome c蛋白的表達(dá)(P＜0.01);模型組Caspase-3蛋白表達(dá)水平較正常組顯著升高(P＜0.01),各劑量的燈盞乙素及高、中劑量的芐酯衍生物可顯著降低細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá)(P＜0.01)。