納米銀離子對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜的細(xì)菌死亡率及其結(jié)構(gòu)的影響.pdf

1、第一部分： [目的]模擬體內(nèi)環(huán)境，體外建立細(xì)菌生物被膜模型，為進(jìn)一步深入研究細(xì)菌生物被膜生物學(xué)特點(diǎn)提供基礎(chǔ)。 [方法]將粘附載體置于氣溶膠法和搖床法模擬體內(nèi)細(xì)菌生物被膜形成的微環(huán)境中，將銅綠假單胞菌株培養(yǎng)3天后，取出標(biāo)本分別進(jìn)行通過(guò)FITC-ConA染色及SYTO9/PI染色，然后分別進(jìn)行熒光顯微鏡檢測(cè)及激光共聚焦檢測(cè)，觀察細(xì)菌生物被膜的形成情況；進(jìn)行電子顯微鏡掃描觀察形成的細(xì)菌生物被膜的形態(tài)特點(diǎn)。 [結(jié)果]在氣

2、溶膠的微環(huán)境下，F(xiàn)ITC-ConA染色后在熒光顯微鏡觀察到明亮成片狀的細(xì)菌生物被膜；SYTO9/PI染色后在激光共聚焦檢測(cè)，觀察到片狀，層疊如積云狀，棉絮樣的細(xì)菌生物被膜；在電子顯微鏡掃描觀察到大量細(xì)菌成團(tuán)聚集，團(tuán)狀叢生突出表面，具有立體結(jié)構(gòu)的細(xì)菌生物被膜。在搖床法的微環(huán)境下，用三種檢測(cè)方法都觀察到成流線狀的細(xì)菌生物被膜。 [結(jié)論]運(yùn)用氣溶膠法、搖床法可成功建立分別模擬體內(nèi)呼吸系統(tǒng)及循環(huán)、泌尿系統(tǒng)的微環(huán)境下生物被膜形成模型。

3、 第二部分： [目的]探討納米銀離子對(duì)細(xì)菌生物被膜（Biofilm，BF）的細(xì)菌死亡率和其空間結(jié)構(gòu)的影響。 [方法]采用搖床法，以納米銀離子含量不同的乙烯-醋酸乙烯酯（Ethylene-Vinyl acetate，EVA）塑料為細(xì)菌粘附載體，模擬體內(nèi)銅綠假單胞菌（P.aeruginosa，PA）BF形成的微環(huán)境，建立體外BF模型；將培養(yǎng)3d的空白標(biāo)本分別在掃描電子顯微鏡（scanning electron micro

4、scopy，SEM）下及用FITC-ConA染色后熒光顯微鏡下觀察不含納米銀EVA中BF的形成情況；將生長(zhǎng)0.5、1、2、3、5d的BF模型行SYTO9/PI染色，激光共聚焦掃描電鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）下攝取不同層面的圖像，然后應(yīng)用Image Pro Plus6.0分析軟件分析不同干預(yù)條件下PAO1菌株BF的細(xì)菌的死亡率和應(yīng)用ISA分析軟件獲得PAO1菌株BF的相關(guān)空間結(jié)構(gòu)參

5、數(shù)定量化數(shù)據(jù)。 [結(jié)果]①運(yùn)用SEM及熒光顯微鏡的方法，在以不含納米銀EVA塑料為細(xì)菌粘附載體上培養(yǎng)3d的標(biāo)本中均觀察到流線狀的BF形成。②Image Pro Plus6.0分析軟件定量化分析顯示，納米銀離子含量、作用時(shí)間對(duì)PAO1菌株BF的細(xì)菌死亡率均有明顯影響（F=84.62，85.67，p<0.0001）；不同時(shí)間組含有納米銀離子材料的PAO1菌株BF的細(xì)菌死亡率均顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05）；納米銀離子含量不同的2

6、種材料上PAO1菌株BF的細(xì)菌死亡率無(wú)明顯影響（P>0.05）；納米銀離子含量不同的（0、0.05％、0.1％）材料上PAO1菌株的BF，其第1、2、3天細(xì)菌死亡率均分別顯著高于第0.5、5d的細(xì)菌死亡率（P<0.05）；含納米銀離子0.1％的材料上BF在作用的第2天其細(xì)菌死亡率最高（88.53±1.88）％。③ISA軟件定量化分析顯示，銀離子含量、作用時(shí)間對(duì)BF空間結(jié)構(gòu)均有明顯影響，不同時(shí)間組含有納米銀離子材料上BF的區(qū)域孔率（Are

7、al Porosity，AP）、平均擴(kuò)散距離（Average Diffusion Distance，ADD）及結(jié)構(gòu)熵（Textural Entropy，TE）影響的均顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05），但2種納米銀離子材料上BF的AP、ADD及TE的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各含納米銀離子材料組PAO1菌株BF的AP值、ADD值無(wú)明顯的變化趨勢(shì)，同一時(shí)間組的含有納米銀離子材料組PAO1菌株BF的AP值都高于空

8、白對(duì)照組的AP值；同一時(shí)間組的含有納米銀離子材料組PAO1菌株BF的ADD值都低于空白對(duì)照組的ADD值。各含納米銀離子材料組PAO1菌株BF的TE值隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，都呈先升高后降低的趨勢(shì)，2d組都為最高值；同一時(shí)間組的TE值隨著含納米銀離子的增加都呈降低趨勢(shì)。④隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各含納米銀離子材料組PAO1菌株BF的平均厚度都呈先升高后降低的趨勢(shì)，3d組都達(dá)最高值；納米銀離子的含量對(duì)BF厚度的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F值=2.11，p>0.1）