整合子在銅綠假單胞菌中的分布及其在生物被膜中作用機(jī)制的研究.pdf

1、銅綠假單胞菌是臨床常見(jiàn)的條件致病菌，耐藥性突出。新近研究發(fā)現(xiàn)該菌在感染過(guò)程中常以生物被膜形式存在，整合子在其耐藥性形成和播散中起重要作用。本研究的目的是探討整合子在我國(guó)銅綠假單胞菌臨床分離株中的分布，以及整合子在該菌生物被膜中的作用機(jī)制。 本研究采用多重聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)分離白河北和昆明兩地的82株銅綠假單胞菌臨床分離株進(jìn)行Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類整合子的檢測(cè)，結(jié)果51株(62.2％)為I類整合子陽(yáng)性菌，1株(1.2％)為II類整合子

2、陽(yáng)性菌，未檢出Ⅲ類整合子陽(yáng)性菌。其中Ⅱ類整合子在銅綠假單胞菌中的存在未見(jiàn)報(bào)道。采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，在51株Ⅰ類整合子陽(yáng)性菌中檢測(cè)到28株(54.9％)攜帶I類整合子相關(guān)基因盒。藥敏結(jié)果顯示Ⅰ類整合子基因盒陽(yáng)性菌株對(duì)哌拉西林、頭孢哌酮、頭孢他啶、妥布霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、氯霉素和復(fù)方磺胺甲嗯唑等抗生素的耐藥率顯著高于未攜帶整合子相關(guān)基因盒的菌株(P

3、石家莊、昆明兩地銅綠假單胞菌臨床分離株中的分布分別是63.5％和60.0％，兩者沒(méi)有顯著性差異；兩地Ⅰ類整合子陽(yáng)性菌中整合子相關(guān)基因盒的攜帶率分別為63.6％和39.0％，兩者具有顯著性差異(P<0.01)，提示環(huán)境等選擇壓力可影響細(xì)菌整合子耐藥基因盒的攜帶。在所檢測(cè)的四株銅綠假單胞菌攜帶的I類整合子相關(guān)基因盒的DNA序列中，都含有耐藥基因，它們分別是氨基葡糖苷—腺苷酰(基)轉(zhuǎn)移酶基因、氨基糖甙腺苷酰(基)轉(zhuǎn)移酶基因、二氫葉酸還原酶基因

4、和鏈霉素3”-腺苷?；D(zhuǎn)移酶基因；同時(shí)四株菌都有相應(yīng)的耐藥表型，表明整合子相關(guān)的耐藥基因在以上菌株中發(fā)揮耐藥作用。質(zhì)粒的接合試驗(yàn)證實(shí)上述四株菌攜帶的整合子位于質(zhì)粒上，該類整合子屬于廣泛分布的優(yōu)勢(shì)整合子，提示這類整合子易借助質(zhì)粒的接合作用在細(xì)菌中廣泛播散。 本研究建立了銅綠假單胞菌生物被膜定性和定量的檢測(cè)方法——平板培養(yǎng)—結(jié)晶紫染色法，在用該法檢測(cè)的48株銅綠假單胞菌臨床菌株中，41株(85.4％)具有生物被膜形成能力，其中25株

5、(52.1％)能力較強(qiáng)。采用腸桿菌基因間重復(fù)一致序列—聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)建立了以上菌株的基因指紋圖譜，在17％基因相似水平上將其分為A、B、C、D、E五個(gè)基因型。生物被膜形成能力較強(qiáng)的菌株在基因型上具有較高的相似性，它們大多為D型或E型，表明該菌臨床分離株大多能形成生物被膜，生物被膜的形成與其基因型有關(guān)。腸桿菌基因間重復(fù)一致序列—聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)銅綠假單胞菌的分型，具有快速、有效、分辨率高等特點(diǎn)，顯示了銅綠假單胞菌臨床菌株基因型的多樣性

6、。本研究采用的銅綠假單胞菌生物被膜定量分析方法和基因分型方法，從表型水平和基因水平為臨床定量檢測(cè)該菌生物被膜的形成和流行病學(xué)研究提供了準(zhǔn)確、實(shí)用的方法。 本研究對(duì)整合子在銅綠假單胞菌生物被膜中的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，采用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)到在銅綠假單胞菌的液相浮游菌、生物被膜菌和被膜脫落菌三種不同生長(zhǎng)狀態(tài)下，都有Ⅰ類整合子整合酶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄；采用競(jìng)爭(zhēng)逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)該菌Ⅰ類整合酶基因在以上三種生長(zhǎng)狀態(tài)的m

7、RNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)生物被膜菌的轉(zhuǎn)錄水平最高，被膜脫落菌次之，液相浮游菌最低；其中生物被膜菌整合酶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平較液相浮游菌高約15倍，較被膜脫落菌高約4倍。提示隨著菌體從生物被膜上脫落，到長(zhǎng)期在液相中以單個(gè)菌體形式生長(zhǎng)，整合酶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平逐漸下調(diào)；即隨著單個(gè)游走細(xì)菌附著于固相實(shí)體表面，在實(shí)體表面形成菌體密度較大的生物被膜，整合酶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄逐漸上調(diào)。生物被膜中菌體間彼此接觸、密度增加，整合子介導(dǎo)的耐

8、藥基因的捕獲和重組可能更加活躍，將有利于菌體遺傳性抗性的提高。關(guān)于整合子在生物被膜中作用機(jī)制的研究國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。 本研究結(jié)果表明Ⅰ類整合子在銅綠假單胞菌臨床分離株中廣泛分布，攜帶的整合子相關(guān)基因盒與其耐藥性密切相關(guān)；該菌大多能形成生物被膜；Ⅰ類整合酶基因在其生物被膜中mRNA的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。本研究結(jié)果提示銅綠假單胞菌生物被膜的形成有利于整合子及相關(guān)耐藥基因的傳播，整合子及相關(guān)耐藥基因的廣泛分布在該菌耐藥性中發(fā)揮重要作用。本研究